Информация

8.5: Лабораторные процедуры - ПЦР и гель-электрофорез - Биология

8.5: Лабораторные процедуры - ПЦР и гель-электрофорез - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Результаты обучения

  • Выполните ПЦР колонии
  • Нанесите агарозный гель на продукты ПЦР

ПЦР колоний (для анализа последовательности 16S рРНК)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это молекулярный метод, используемый для амплификации определенных участков ДНК для таких приложений, как секвенирование и генетический анализ. Обычно количество ДНК в образце для исследования ограничено, и требуется амплификация. ПЦР проводится в пробирке с ДНК-матрицей, праймерами, специфичными для желаемой области, ДНК-полимеразой и реагентами, стабилизирующими реакцию. Как только реакция будет проведена, она попадет в термоциклер (ПЦР-машину), который создаст условия для репликации ДНК. Каждый раунд ПЦР требует трех этапов: денатурации, отжига и удлинения, каждая из которых удваивает количество ДНК-матрицы, присутствующей в реакции. Повторение этого процесса несколько раз, обычно 30 раз, приведет к экспоненциальному усилению ДНК.

Метод гранул ПЦР

Материалы:

· Праймер 27F (запас 20 мкм)

· Праймер 1492R (20 мкм на складе)

· GE Illustra PuReTaq Готовые к использованию шарики и пробирки для ПЦР

· Стерильная деионизированная вода, не содержащая нуклеаз (молекулярная чистота)

· Планшет T-Streak с бактериальным изолятом

· Микропипетки и наконечники (P10, P100)

Процедуры

Адаптировано из руководства «Готовые шарики для ПЦР GE Illustra PuRe Taq»

  1. Приобретите пробирки с шариками для ПЦР, которые содержат Taq-полимеразу (термостойкий фермент) и другие необходимые реагенты. Используя острый предмет, пометьте верхнюю часть пробирок номером реакции ПЦР, присвоенным классу. Следите за тем, чтобы случайно не стереть его при работе с пробиркой, и дважды проверьте, вставляя пробирку в машину для ПЦР, что ваша этикетка все еще видна.
  2. Добавьте 25 мкл мастер-смеси (содержит воду молекулярной чистоты + праймеры 16S рРНК) в пробирку с шариками для ПЦР. Бусинка начнет растворяться и слегка закипать.
  3. Во время дозирования мастер-микса вставьте наконечник микропипетки в смесь так, чтобы вы действительно видеть небольшой объем идет прямо в микс.
  4. С помощью наконечника микропипетки осторожно прикоснитесь к колонии на пластине для штриховки. Небольшой видимый мазок клеток, который едва заполняет самый конец наконечника пипетки, обеспечит достаточное количество ДНК-матрицы для реакции.
  5. Окуните наконечник пипетки в реакционную смесь и осторожно вращайте в течение 5-10 секунд, чтобы удалить клетки. Закройте пробирки крышкой. Избегайте образования пузырей.
  6. Перенести пробирки в термоциклер.
  7. Выберите подходящую программу †, чтобы начать цикл (около 2 часов).
  8. После завершения цикла удалите пробирки и инкубируйте на льду. Следуйте инструкциям своего инструктора по хранению и последующим протоколам, чтобы проверить качество продуктов ПЦР и подготовить их к секвенированию.

*** Протокол адаптирован из руководства «puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads» *

Праймеры 16S рРНК:

Прямой праймер (27F)

5 ’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’

Обратный праймер (1492R)

5 ’- ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT - 3’

Протокол цикла ПЦР:

1. 94оC в течение 10 мин.

2. 94оC 30 сек - шаг денатурации

3. 58оC 30 сек - шаг отжига

4. 72оC 1 мин 50 сек (1 мин на тысячу килограммов ДНК-матрицы) - стадия элонгации

5. Повторите шаги 2–4 30 раз.

6. 72оC в течение 10 минут - заключительный шаг продления

Электрофорез в агарозном геле

Для визуализации и анализа нам придется «прогнать» продукты ПЦР на агарозном геле. Будет использоваться электронная гелевая система Invitrogen. Эта система представляет собой полную безбуферную систему для электрофореза в агарозном геле. Существует предварительно отлитый агарозный гель (E-гель), который представляет собой автономный гель, который включает электроды, упакованные внутри сухой одноразовой прозрачной для УФ-излучения кассеты. Гель содержит либо Sybr-safe, либо бромид этидия для визуализации ДНК. E-gel работает в одном устройстве, которое одновременно является базой и источником питания, называемым E-gel Powerbase.

Протокол и изображения, приведенные ниже, адаптированы из Технического руководства Invitrogen's E-gel.

Материалы

· Образец ДНК (из реакции ПЦР)

· 1 КБ маркеров молекулярной массы

· Загрузка смеси красителей

Общие рекомендации

· Запустить гели, хранящиеся при комнатной температуре

· Обеспечьте однородность образцов и загрузите деионизированную воду в пустые лунки.

· Нанесите гель в течение 15 минут после открытия пакета.

· E-гель можно использовать только один раз

Процедура

Подготовка образцов и загрузка геля:

Подготовьте образцы ДНК, добавив деионизированную воду к необходимому количеству ДНК, чтобы довести общий объем образца до 20 мкл.

1. Инструктор лаборатории добавит в гель лестницу размером 1 КБ.

2. Добавьте 4 мкл реакции ПЦР в новую микроцентрифужную пробирку.

3. Добавьте 16 мкл загрузочной смеси красителей в эту микроцентрифужную пробирку.

4. После настройки базы питания E-gel (см. Ниже), загрузите весь объем 20 мкл в лунку нужного геля. Обязательно запишите, в какой гель вы загрузили образец.

Настройка E-gel Powerbase:

1. Подключите Powerbase к электрической розетке с помощью переходной вилки.

2. Откройте упаковку с гелем и вставьте гель (вставкой) в прибор сначала правым краем. Сильно нажмите сверху и снизу, чтобы гель вошел в основу. Когда он встанет на место, вы должны услышать щелчок. Логотип Invitrogen должен располагаться внизу основания, рядом с положительным полюсом. См. Диаграмму ниже. Постоянный красный свет указывает на то, что гель вставлен правильно (режим готовности).

Очистка ПЦР

Процесс очистки ПЦР выполняется с использованием коммерческого продукта. В зависимости от наличия различных коммерческих наборов ваш технический специалист определит и предоставит набор для использования в лаборатории. Инструкции будут предоставлены вместе с комплектом.


8.5: Лабораторные процедуры - ПЦР и гель-электрофорез - Биология

Гель-электрофорез: TAE и агароза / загрузочный краситель

Сегодня я начал свой день с изучения гель-электрофореза.

После ПЦР гель-электрофорез помогает идентифицировать скопированную нами цепь ДНК.

Использовали буфер для электрофореза, обычно трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ), который смешивали с порошком агарозы для получения концентрации геля агарозы в диапазоне 0,5-1,4%. Обычно в большинстве случаев концентрация геля агарозы устанавливается на уровне 1%.

Когда используется 0,4 грамма порошка агарозы, затем 40 мл TAE смешивают с образованием геля агарозы. Гель агарозы нагревают в микроволновке 2-3 минуты и переливают в пластиковую емкость на 30 минут для просушки.

После того, как он высохнет, каждый образец ДНК вставляется в полости гребня (также называемые лунками). ДНК вставляется в загрузочный краситель. При использовании пипетки для введения образца ДНК следует проявлять осторожность, чтобы не повредить гель, который был приготовлен ранее. Пипетка никогда не должна контактировать с гелем. Краска для загрузки часто бывает пурпурного или синего цвета, которая помогает ДНК опускать гель в полости гребней (лунок) и помогает защитить ДНК. Если краситель не используется, тогда ДНК будет плавать, и мы не сможем отследить ДНК. Затем к пластиковому контейнеру подключается электричество (источник питания), так что отрицательно заряженная ДНК может перемещаться от заряженного электрода к заряженному электроду соответственно. Маленькие образцы перемещаются быстрее и поэтому находятся ближе к заряженному электроду «39 +», тогда как более крупные образцы перемещаются медленнее и, следовательно, находятся ближе к заряженному электроду.

После подключения источника питания часть пластикового контейнера / гребня перемещается в гелевый документ, где УФ-камера делает снимок образца ДНК.


Протокол

1. Разработка праймеров

Разработка подходящих праймеров имеет важное значение для успешного результата эксперимента ПЦР. При разработке набора праймеров для конкретной области ДНК, желаемой для амплификации, один праймер должен отжигаться с положительной цепью, которая по соглашению ориентирована в направлении 5 'и # x02192 3' (также известном как смысловая или неэлементная цепь). а другой праймер должен дополнять минус-цепь, которая ориентирована в направлении 3 '& # x02192 5' (антисмысловая или матричная цепь). При разработке праймеров возникает несколько общих проблем: 1) самоотжиг праймеров, приводящий к образованию вторичных структур, таких как петли шпильки (Рисунок 1а) 2) праймеры отжигаются друг с другом, а не с матрицей ДНК, создавая димеры праймеров (Рисунок 1b) 3) резко различающиеся температуры плавления (Tм) для каждого праймера, что затрудняет выбор температуры отжига, которая позволит обоим праймерам эффективно связываться со своей целевой последовательностью во время тематического цикла (Рисунок 1c) (См. Разделы РАСЧЕТ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ (Tм) и ИЗМЕНЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ВЕЛОСИПЕДА для получения дополнительной информации о Tмс).

Ниже приведен список характеристик, которые следует учитывать при проектировании грунтовок.

Длина праймера должна составлять 15-30 нуклеотидных остатков (оснований).

Оптимальное содержание G-C должно составлять 40-60%.

3'-конец праймеров должен содержать буквы G или C, чтобы зажимать праймер и предотвращать «дыхание» концов, увеличивая эффективность прайминга. «Дыхание» ДНК происходит, когда концы не остаются отожженными, а истираются или расщепляются. Три водородные связи в парах GC помогают предотвратить дыхание, но также увеличивают температуру плавления праймеров.

3'-концы набора праймеров, который включает праймер с положительной цепью и праймер с отрицательной цепью, не должны быть комплементарными друг другу, а 3'-конец одного праймера не может быть комплементарным другим последовательностям в праймере. Эти два сценария приводят к образованию димеров праймеров и структур петель шпильки соответственно.

Оптимальные температуры плавления (Тм) для праймеров находится в диапазоне 52-58 ° C, хотя диапазон может быть расширен до 45-65 ° C. Финальный Tм для обоих праймеров должно отличаться не более чем на 5 & # x000b0C.

Следует избегать динуклеотидных повторов (например, GCGCGCGCGC или ATATATATAT) или прогонов с одним основанием (например, AAAAA или CCCCC), поскольку они могут вызвать проскальзывание по праймированному сегменту ДНК и / или образование структур шпилечной петли. Если это неизбежно из-за природы матрицы ДНК, включайте только повторы или прогоны с одним основанием максимум с 4 основаниями.

Примечания:

Существует множество компьютерных программ, предназначенных для помощи в создании пар праймеров. Для этой цели рекомендуются веб-сайты NCBI Primer design tool http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ и Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/.

Чтобы избежать амплификации родственных псевдогенов или гомологов, может быть полезно запустить анализ NCBI для проверки целевой специфичности праймеров.

2. Материалы и реагенты

При настройке эксперимента ПЦР важно быть готовым. Надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения реакционной смеси или реагентов. Включите отрицательный контроль и, если возможно, положительный контроль.

Поместите все реагенты, необходимые для эксперимента ПЦР, в свежезаполненное ведро со льдом и дайте им полностью оттаять перед началом реакции (фигура 2). Держите реагенты на льду на протяжении всего эксперимента.

Стандартные реагенты для ПЦР включают набор подходящих праймеров для желаемого целевого гена или сегмента ДНК, который необходимо амплифицировать, ДНК-полимеразу, буфер для конкретной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотиды (dNTP), ДНК-матрицу и стерильную воду.

Дополнительные реагенты могут включать магниевую соль Mg 2+ (в конечной концентрации от 0,5 до 5,0 мМ), калиевую соль K + (в конечной концентрации от 35 до 100 мМ), диметилсульфоксид (ДМСО в конечной концентрации 1-10%). , формамид (в конечной концентрации 1,25-10%), бычий сывороточный альбумин (в конечной концентрации 10-100 мкг / мл) и бетаин (в конечной концентрации от 0,5 М до 2,5 М). Присадки обсуждаются далее в разделе «Устранение неисправностей».

Разложите лабораторное оборудование на верстаке.

Материалы включают пробирки и крышки для ПЦР, штатив для пробирок для ПЦР, устойчивый к этанолу маркер и набор микропипеток, которые дозируют от 1 до 10 & # x003bcl (P10), 2-20 & # x003bcl (P20), 20-200 & # x003bcl (P200) и 200 - 1000 & # x003bcl (P1000), а также термоциклер.

При настройке нескольких экспериментов ПЦР, в которых используются одни и те же реагенты, их можно соответствующим образом масштабировать и объединить в мастер-смесь (мастер-микс). Этот шаг можно выполнить в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,8 мл (см. Примечания).

Для анализа ампликонов, полученных в результате эксперимента ПЦР, требуются реагенты и оборудование для электрофореза в агарозном геле. Чтобы приблизиться к размеру продукта ПЦР, необходим соответствующий коммерчески доступный стандарт размера молекулярной массы.

3. Создание реакционной смеси.

Начните с составления таблицы реагентов, которые будут добавлены в реакционную смесь (см. Таблица 1).

Затем пометьте пробирки для ПЦР маркером устойчивости к этанолу.

Объемы реакции будут варьироваться в зависимости от концентраций исходных реагентов. Конечные концентрации (CF) для типичной реакции 50 мкл являются следующими.

X буфер (обычно поставляется производителем ДНК-полимеразы, может содержать 15 мМ MgCl2). Добавьте 5 мкл 10-кратного буфера на реакцию.

200 мкМ dNTP (50 мкМ каждого из четырех нуклеотидов). Добавьте 1 & # x003bcl из 10 мМ dNTP на реакцию (dATP, dCTP, dTTP и dGTP составляют 2,5 мМ каждая).

1,5 мМ Mg 2+. Добавляйте только в том случае, если его нет в 10-кратном буфере или при необходимости для оптимизации ПЦР. Например, для получения 4,0 мМ Mg 2+, необходимого для оптимального продуцирования ампликона консервативного сегмента ДНК длиной 566 п.н., обнаруженного в не охарактеризованном микобактериофаге, добавьте 8 & # x003bcl 25 мМ MgCl.2 на реакцию (Рисунок 3).

От 20 до 50 пмоль каждого праймера. Добавьте по 1 & # x003bcl каждого праймера 20 & # x003bcM.

Добавьте от 10 4 до 10 7 молекул (или примерно от 1 до 1000 нг) ДНК-матрицы. Добавьте 0,5 & # x003bcl 2ng / & # x003bcl геномной ДНК микобактериофага.

Добавьте от 0,5 до 2,5 единиц ДНК-полимеразы на реакцию 50 & # x003bcl (см. Рекомендации производителя). Например, добавьте 0,5 & # x003bcl Sigma 0,5 единиц / & # x003bcl. Taq ДНК-полимераза.

Добавить Q.S. стерильной дистиллированной воды для получения конечного объема 50 мкл на реакцию, как предварительно определено в таблице реагентов (Q.S. - латинское сокращение от Quant Satis, означающее необходимое количество). Таким образом, для доведения объема до 50 мкл на реакцию требуется 33 мкл на реакцию. Однако следует отметить, что вода добавляется первой, но для этого необходимо сначала составить таблицу реагентов и определить объемы всех других реагентов, добавляемых в реакцию.

4. Базовый протокол ПЦР.

Поместите 96-луночный планшет в ведерко для льда в качестве держателя для тонкостенных ПЦР-пробирок объемом 0,2 мл. Добавление реагентов для ПЦР в холодные тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл поможет предотвратить нуклеазную активность и неспецифическое праймирование.

Пипетируйте следующие реагенты для ПЦР в следующем порядке в тонкостенную пробирку для ПЦР объемом 0,2 мл (Рисунок 4): Стерильная вода, 10-кратный буфер для ПЦР, dNTP, MgCl.2, праймеры и матричная ДНК (см. Таблица 1). Поскольку в экспериментах должен быть как минимум отрицательный контроль и, возможно, положительный контроль, полезно установить мастер-микс в микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл (см. Пояснения в примечаниях).

В отдельных тонкостенных пробирках для ПЦР объемом 0,2 мл (Рисунок 4) добавьте все реагенты, за исключением ДНК-матрицы для отрицательного контроля (увеличьте количество воды, чтобы компенсировать недостающий объем). Кроме того, другая реакция (если доступны реагенты) должна содержать положительный контроль с использованием матричной ДНК и / или праймеров, ранее известных для амплификации в тех же условиях, что и экспериментальные пробирки для ПЦР.

Taq ДНК-полимераза обычно хранится в 50% растворе глицерина, и для полного диспергирования в реакционной смеси требуется осторожное перемешивание реагентов ПЦР путем пипетирования вверх и вниз не менее 20 раз. При смешивании микропипеточный дозатор должен быть настроен примерно на половину реакционного объема мастер-микса, и следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить появления пузырьков.

Закройте тонкостенные ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл крышками и поместите их в термоциклер (Рисунок 5.). Как только крышка термоциклера будет плотно закрыта, запустите программу (см. Таблица 2).

По завершении программы тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл можно удалить и хранить при 4 ° C. Продукты ПЦР могут быть обнаружены путем загрузки аликвот каждой реакции в лунки агарозного геля и последующего окрашивания ДНК, которая переместилась в гель после электрофореза с бромидом этидия. Если присутствует продукт ПЦР, бромид этидия будет внедряться между основаниями цепей ДНК, позволяя визуализировать полосы с помощью УФ-осветителя.

Примечания:

При настройке нескольких экспериментов ПЦР выгодно собрать смесь реагентов, общих для всех реакций (т. Е. Мастер-смесь). Обычно коктейль содержит раствор ДНК-полимеразы, dNTP, реакционный буфер и воду, собранный в микроцентрифужной пробирке объемом 1,8 мл. Количество каждого реагента, добавляемого в мастер-микс, эквивалентно общему количеству реакций плюс 10%, округленное до ближайшей целой реакции. Например, если имеется 10 x 0,1 = 1 реакция, то (10 + 1) x 5 & # x003bcl 10X буфер равняется 55 & # x003bcl 10X буфера для Master Mix. Реагенты в мастер-миксе тщательно перемешивают, осторожно покачивая поршень микропипеточной машины вверх и вниз примерно 20 раз, как описано выше. В каждую пробирку для ПЦР добавляют аликвоту основной смеси, в которую затем добавляют матрицу ДНК, любые необходимые праймеры и реагенты для конкретного эксперимента (см. Таблицы 1 и 7).

На следующем веб-сайте предлагается калькулятор для определения количества копий шаблона ДНК (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html). Общее количество копий двухцепочечной ДНК можно рассчитать, используя следующее уравнение: Количество копий ДНК = (количество ДНК (нг) x 6,022x10 23) / (длина ДНК x 1x10 9 нг / мл x 650 дальтон) Расчет количества копий ДНК используется для определения количества шаблона, необходимого для реакции.

Ложноположительные результаты могут возникать в результате переноса из другой реакции ПЦР, которая будет визуализирована как множество нежелательных продуктов на агарозном геле после электрофореза. Поэтому разумно использовать правильную технику, включая отрицательный контроль (и, если возможно, положительный контроль).

Хотя бромид этидия является наиболее распространенным красителем нуклеиновых кислот, существует несколько более безопасных и менее токсичных альтернатив. На следующем веб-сайте описаны несколько альтернатив, включая Methylene Blue, Crystal Violet, SYBR Safe и Gel Red, а также описаны способы использования и обнаружения конечного продукта (http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- альтернативы /).

В то время как в большинстве современных ПЦР-машин используются пробирки на 0,2 мл, для некоторых моделей могут потребоваться реакции в пробирках на 0,5 мл. См. Руководство по эксплуатации вашего термоциклера, чтобы определить трубку подходящего размера.

5. Расчет температуры плавления (Tм)

Зная температуру плавления (Tм) праймеров является обязательным условием успешного эксперимента ПЦР. Хотя есть несколько Tм доступных калькуляторов, важно отметить, что эти расчеты являются оценкой фактического Tм из-за отсутствия конкретной информации о конкретной реакции и предположений, сделанных в алгоритмах для Tм сами калькуляторы. Однако термодинамические модели ближайших соседей предпочтительнее более традиционных расчетов: Tм & # x02248 4 (G-C) + 2 (A-T). Первый даст более точный Tм оценка, потому что она учитывает энергию суммирования соседних пар оснований. Последний используется чаще, потому что расчеты просты и могут быть быстро выполнены вручную. См. Раздел «Поиск и устранение неисправностей» для получения информации о том, как различные условия ПЦР и добавки влияют на температуру плавления. Для расчета Tм значений термодинамических моделей ближайшего соседа рекомендуется использовать один из следующих калькуляторов: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. Настройка условий термоциклирования.

Термоциклеры для ПЦР быстро нагревают и охлаждают реакционную смесь, обеспечивая тепловую денатурацию дуплексной ДНК (разделение цепей), отжиг праймеров к положительным и отрицательным цепям матрицы ДНК и удлинение продукта ПЦР. Время цикла рассчитывается на основе размера матрицы и содержания ДНК в ГХ. Общая формула начинается с начальной стадии денатурации при температуре от 94 ° C до 98 ° C в зависимости от оптимальной температуры для активности ДНК-полимеразы и содержания G-C в матричной ДНК. Типичная реакция начинается с денатурации в течение одной минуты при 94 ° C. Более 3 минут могут инактивировать ДНК-полимеразу, нарушая ее ферментативную активность. Один метод, известный как ПЦР с горячим стартом, резко увеличивает время начальной денатурации с 3 до 9 минут. При ПЦР с горячим стартом ДНК-полимераза добавляется после завершения начальной стадии преувеличенной денатурации. Эта модификация протокола позволяет избежать вероятной инактивации фермента ДНК-полимеразы. Обратитесь к разделу «Устранение неполадок» этого протокола для получения дополнительной информации о ПЦР с горячим запуском и других альтернативных методах.

Следующим шагом является настройка термоциклера на запуск первого из 25-35 циклов трехступенчатого температурного цикла (Таблица 2). Хотя увеличение количества циклов выше 35 приведет к большему количеству продуктов ПЦР, слишком большое количество циклов часто приводит к обогащению нежелательных вторичных продуктов. Три температурных шага в одном цикле решают три задачи: первый шаг денатурирует матрицу (а в последующих циклах также и ампликоны), второй шаг обеспечивает оптимальный отжиг праймеров, а третий шаг позволяет ДНК-полимеразе связываться с матрицу ДНК и синтезировать продукт ПЦР. Продолжительность и температура каждого этапа в цикле могут быть изменены, чтобы оптимизировать производство желаемого ампликона. Время стадии денатурации должно быть как можно короче. Обычно для большинства шаблонов ДНК достаточно от 10 до 60 секунд. Время денатурации и температура могут варьироваться в зависимости от содержания G-C в матричной ДНК, а также от скорости линейного изменения, то есть времени, которое требуется термоциклеру для перехода от одной температуры к другой. Температура на этом этапе обычно такая же, как и на начальной стадии денатурации (шаг №1 выше, например, 94 & # x000b0C). В рамках цикла следует 30-секундный этап отжига при температуре, установленной примерно на 5 ° C ниже кажущейся T.м праймеров (в идеале от 52 & # x000b0C до 58 & # x000b0C). Цикл завершается этапом удлинения. Температура зависит от выбранной для эксперимента ДНК-полимеразы. Например, Taq ДНК-полимераза имеет оптимальную температуру элонгации от 70 ° C до 80 ° C, и ей требуется 1 минута для удлинения первых 2 т.п.н., затем требуется дополнительная минута для каждого дополнительного амплифицированного 1 т.п.н. ДНК-полимераза Pfu - еще один термостабильный фермент, оптимальная температура удлинения которого составляет 75 ° C. ДНК-полимераза Pfu рекомендуется для использования в ПЦР и реакциях удлинения праймера, которые требуют высокой точности и требуют 2 минут для амплификации каждого 1 т.п.н. См. Рекомендации производителя для получения точных значений температуры и времени удлинения, указанных для каждой конкретной ДНК-полимеразы.

Заключительная фаза термоциклирования включает в себя продолжительный период удлинения на 5 минут или дольше. Этот последний шаг позволяет завершить синтез многих незавершенных ампликонов, а в случае Taq ДНК-полимераза позволяет добавлять остаток аденина к 3'-концам всех продуктов ПЦР. Эта модификация опосредуется терминальной трансферазной активностью Taq ДНК-полимераза и полезна для последующих процедур молекулярного клонирования, которые требуют 3'-выступа.

Прекращение реакции достигается охлаждением смеси до 4 ° C и / или добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

7. Важные соображения при поиске и устранении неисправностей ПЦР

Если стандартные условия ПЦР не дают желаемого ампликона, оптимизация ПЦР необходима для достижения лучших результатов. Строгость реакции можно регулировать таким образом, чтобы специфичность регулировалась изменением переменных (например, концентраций реагентов, условий цикла), которые влияют на результат профиля ампликона. Например, если реакция недостаточно строгая, будет создано много ложных ампликонов переменной длины. Если реакция будет слишком жесткой, продукт не будет производиться. Устранение неполадок в реакциях ПЦР иногда может быть неприятным занятием. Однако тщательный анализ и хорошее понимание реагентов, используемых в эксперименте ПЦР, может сократить количество времени и испытаний, необходимых для получения желаемых результатов. Из всех факторов, влияющих на строгость ПЦР, титрование Mg 2+ и / или изменение температуры отжига, вероятно, решит большинство проблем. Однако, прежде чем что-либо менять, убедитесь, что ошибочный результат не произошел по вине человека. Начните с подтверждения того, что все реагенты были добавлены к данной реакции и что реагенты не были загрязнены. Также обратите внимание на ошибочный результат и задайте следующие вопросы: Видны ли димеры праймеров на геле после электрофореза (они проявляются в виде небольших полос & # x0003c100b в нижней части полосы)? Существуют ли неспецифические продукты (полосы, размер которых отличается от размера желаемого продукта)? Не хватало какого-то продукта? Находится ли целевая ДНК на плазмиде или в экстракте геномной ДНК? Кроме того, целесообразно проанализировать содержание G-C в желаемом ампликоне.

Сначала определите, является ли какой-либо из реагентов ПЦР катастрофическим для вашей реакции. Этого можно достичь, приготовив новые реагенты (например, свежие рабочие растворы, новые разведения), а затем систематически добавляя по одному новому реагенту за раз к реакционным смесям. Этот процесс определит, какой реагент был виновником неудачного эксперимента ПЦР. В случае очень старой ДНК, которая часто накапливает ингибиторы, было продемонстрировано, что добавление бычьего сывороточного альбумина может помочь облегчить проблему.

Димеры праймера могут образовываться, когда праймеры предпочтительно самоотжигаются или отжигаются с другим праймером в реакции. Если это произойдет, на агарозном геле появится небольшой продукт размером менее 100 п.н. Начните с изменения соотношения матрицы и праймера, если концентрация праймера значительно превышает концентрацию матрицы, тогда праймеры будут с большей вероятностью отжигаться друг с другом по матрице ДНК. Добавление ДМСО и / или использование метода термоциклирования при горячем запуске может решить проблему. В конце концов, может потребоваться разработка новых грунтовок.

Неспецифические продукты образуются, когда строгость ПЦР слишком низкая, что приводит к неспецифическим полосам ПЦР переменной длины. Это дает эффект лестницы на агарозном геле. Затем рекомендуется выбрать условия ПЦР, которые повышают строгость. Мазок различного размера также может быть результатом использования праймеров, предназначенных для многократно повторяющихся последовательностей при амплификации геномной ДНК. Однако те же самые праймеры могут амплифицировать последовательность-мишень на плазмиде, не сталкиваясь с той же проблемой.

Отсутствие продуктов ПЦР, вероятно, связано с слишком жесткими условиями реакции. Димеры праймеров и структуры петли шпильки, которые образуются с праймерами или в денатурированной матричной ДНК, также могут препятствовать амплификации продуктов ПЦР, поскольку эти молекулы больше не могут образовывать пары оснований с желаемым аналогом ДНК.

Если контент G-C не был проанализирован, пора это сделать. ПЦР богатых G-C регионов (содержание GC & # x0003e60%) представляет собой одну из самых серьезных проблем для ПЦР. Тем не менее, есть много добавок, которые помогают облегчить проблемы.

8. Манипулирование реагентами для ПЦР.

Понимание функции реагентов, используемых в обычной ПЦР, имеет решающее значение при первом решении, как лучше всего изменить условия реакции для получения желаемого продукта. Успех просто может зависеть от изменения концентрации MgCl.2, KCl, dNTP, праймеры, матричная ДНК или ДНК-полимераза. Однако неправильная концентрация таких реагентов может привести к ложным результатам, что снизит жесткость реакции. При устранении неполадок ПЦР следует манипулировать только одним реагентом за раз. Однако может быть разумным титровать реагент, с которым производятся манипуляции.

Соль магния Mg 2+ (конечная реакционная концентрация от 0,5 до 5,0 мМ) Термостабильные ДНК-полимеразы требуют присутствия магния, чтобы действовать в качестве кофактора во время процесса реакции. Изменение концентрации магния - один из самых простых реагентов, с которым, возможно, больше всего влияют на строгость ПЦР. Как правило, выход продукта ПЦР увеличивается при добавлении более высоких концентраций Mg 2+. Однако повышенные концентрации Mg 2+ также уменьшают специфичность и точность ДНК-полимеразы. Большинство производителей включают раствор хлорида магния (MgCl2) вместе с ДНК-полимеразой и 10-кратным буферным раствором для ПЦР. Буферные растворы для 10-кратной ПЦР могут содержать 15 мМ MgCl.2, которого достаточно для типичной реакции ПЦР, или его можно добавлять отдельно в концентрации, оптимизированной для конкретной реакции. Mg 2+ фактически не расходуется в реакции, но реакция не может протекать без его присутствия. Когда присутствует слишком много Mg 2+, это может предотвратить полную денатурацию ДНК-матрицы за счет стабилизации дуплексной цепи. Слишком много Mg 2+ также может стабилизировать ложный отжиг праймеров на неправильные сайты-матрицы и снизить специфичность, что приведет к нежелательным продуктам ПЦР. Когда Mg 2+ недостаточно, реакция не будет продолжаться, что приведет к отсутствию продукта ПЦР.

Калиевая соль K + (конечная реакционная концентрация от 35 до 100 мМ) Более длинные продукты ПЦР (от 10 до 40 т.п.н.) выигрывают от восстановления калиевой соли (KCl) по сравнению с ее нормальной реакционной концентрацией 50 мМ, часто в сочетании с добавлением ДМСО и / или глицерин. Если желаемый ампликон ниже 1000 п.н. и образуются длинные неспецифические продукты, специфичность можно улучшить титрованием KCl, увеличивая концентрацию с шагом 10 мМ до 100 мМ. Увеличение концентрации соли позволяет более коротким молекулам ДНК денатурировать предпочтительно более длинным молекулам ДНК.

Дезоксинуклеотид-5'-трифосфаты (конечная реакционная концентрация 20 и 200 & # x003bcM каждый) Дезоксинуклеотид-5'-трифосфаты (dNTP) могут вызвать проблемы для ПЦР, если они не находятся в соответствующих эквивалентных концентрациях (например, [A] = [T] = [C] = [G]) и / или из-за их нестабильности из-за многократного замораживания и оттаивания. Обычная концентрация dNTP составляет 50 мкМ каждого из четырех dNTP. Однако ПЦР может выдерживать концентрации от 20 до 200 мкМ каждая. Более низкие концентрации dNTP могут повысить как специфичность, так и точность реакции, в то время как чрезмерные концентрации dNTP могут фактически ингибировать ПЦР. Однако для более длинных ПЦР-фрагментов может потребоваться более высокая концентрация dNTP. Большое изменение концентрации dNTP может потребовать соответствующего изменения концентрации Mg 2+.

Термостабильные ДНК-полимеразы Ферменты и буферы ПЦР, связанные с этими ферментами, прошли долгий путь с момента появления первых Taq Впервые была использована ДНК-полимераза. Таким образом, выбор подходящего фермента может быть полезным для получения желаемых продуктов ампликона. Например, использование Taq ДНК-полимераза может быть предпочтительнее ДНК-полимеразы Pfu, если желательна процессивность и / или добавление остатка аденина к 3'-концам продукта ПЦР. Добавление 3'-аденина стало полезной стратегией клонирования продуктов ПЦР в ТА-векторы с 3'-выступами тимина. Однако, если точность воспроизведения важнее, лучшим выбором может быть фермент, такой как Pfu. Некоторые производители имеют ряд конкретных ДНК-полимераз, разработанных для особых нужд. Взгляните на условия реакции и характеристики желаемого ампликона, а затем сравните эксперимент ПЦР с соответствующей ДНК-полимеразой. У большинства производителей есть таблицы, которые помогают отбору ДНК-полимеразы, перечисляя такие характеристики, как точность, выход, скорость, оптимальные длины мишеней, а также то, полезно ли это для амплификации с высоким содержанием G-C или ПЦР с горячим стартом.

Качество и чистота матричной ДНК ДНК будут иметь существенное влияние на вероятность успешного эксперимента ПЦР. Концентрации ДНК и РНК можно определить с помощью измерений их оптической плотности при 260 нм (OD260). Масса очищенных нуклеиновых кислот в растворе рассчитывается как 50 мкг / мл двухцепочечной ДНК или 40 мкг / мл для РНК или одноцепочечной ДНК при OD.260 = 1.0. Загрязняющие вещества экстракции ДНК являются обычными ингибиторами ПЦР, и их следует осторожно избегать. Общие ингибиторы экстракции ДНК при ПЦР включают белок, РНК, органические растворители и детергенты. Использование максимального поглощения нуклеиновых кислот OD260 по сравнению с белками OD280 (OD260/280), можно определить оценку чистоты экстрагированной ДНК. В идеале соотношение OD260/280 находится между 1,8 и 2,0. Нижний наружный диаметр260/280 указывает на загрязнение белком и / или растворителем, что, по всей вероятности, будет проблематичным для ПЦР. Помимо качества ДНК-матрицы, оптимизация количества ДНК может значительно улучшить результат эксперимента ПЦР. Хотя удобно определять количество в нг / & # x003bcl, которое часто является выходом для современных наноспектрофотометров, соответствующей единицей для успешного эксперимента ПЦР является количество молекул. То есть сколько копий ДНК-матрицы содержат последовательность, комплементарную праймерам ПЦР? Оптимальные молекулы-мишени составляют от 10 4 до 10 7 молекул и могут быть рассчитаны, как описано в примечаниях выше.

9. Аддитивные реагенты.

Аддитивные реагенты могут дать результат, когда ничего не помогает. Понимание реагентов и того, для чего они используются, имеет решающее значение для определения того, какие реагенты могут быть наиболее эффективными для получения желаемого продукта ПЦР. Добавление реагентов в реакцию осложняется тем фактом, что манипуляции с одним реагентом могут повлиять на пригодную для использования концентрацию другого реагента. In addition to the reagents listed below, proprietary commercially available additives are available from many biotechnology companies.

10. Additives That Benefit G-C Rich Templates

Dimethylsulfoxide (final reaction concentration of 1-10% DMSO) In PCR experiments in which the template DNA is particularly G-C rich (GC content 㹠%), adding DMSO may enhance the reaction by disrupting base pairing and effectively lowering the Tм. Some Tм calculators include a variable entry for adding the concentration of DMSO desired in the PCR experiment. However, adding more than 2% DMSO may require adding more DNA polymerase as it has been demonstrated to inhibit Taq ДНК-полимераза.

Formamide (final reaction concentration of 1.25-10%) Like DMSO, formamide also disrupts base pairing while increasing the stringency of primer annealing, which results in less non-specific priming and increased amplification efficiency. Formamide also has been shown to be an enhancer for G-C rich templates.

7-deaza-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (final reaction concentration of dc 7 GTP 3 dc 7 GTP:1 dGTP 50 μM) Using 3 parts, or 37.5 μM, of the guanosine base analog dc 7 GTP in conjunction with 1 part, or 12.5 μM, dGTP will destabilize formation of secondary structures in the product. As the amplicon or template DNA is denatured, it will often form secondary structures such as hairpin loops. Incorporation of dc 7 GTP into the DNA amplicon will prohibit formation of these aberrant structures.

dc 7 GTP attenuates the signal of ethidium bromide staining which is why it is used in a 3:1 ratio with dGTP.

Betaine (final reaction concentration of 0.5M to 2.5M) Betaine (N,N,N-trimethylglycine) is a zwitterionic amino acid analog that reduces and may even eliminate the DNA melting temperature dependence on nucleotide composition. It is used as an additive to aid PCR amplification of G-C rich targets. Betaine is often employed in combination with DMSO and can greatly enhance the chances of amplifying target DNA with high G-C content.

11. Additives That Help PCR in the Presence of Inhibitors

Non ionic detergents function to suppress secondary structure formation and help stabilize the DNA polymerase. Non ionic detergents such as Triton X-100, Tween 20, or NP-40 may be used at reaction concentrations of 0.1 to 1% in order to increase amplicon production. However, concentrations above 1% may be inhibitory to PCR. The presence of non ionic detergents decreases PCR stringency, potentially leading to spurious product formation. However, their use will also neutralize the inhibitory affects of SDS, an occasional contaminant of DNA extraction protocols.

Addition of specific proteins such as Bovine serum albumin (BSA) used at 400 ng/μl and/ or T4 gene 32 protein at 150 ng/μl aid PCR in the presence of inhibitors such as FeCl3, hemin, fulvic acid, humic acid, tannic acids, or extracts from feces, fresh water, and marine water. However, some PCR inhibitors, including bile salts, bilirubin, EDTA, NaCl, SDS, or Triton X-100, are not alleviated by addition of either BSA or T4 gene 32 protein.

12. Modifications to Cycling Conditions

Optimizing the annealing temperature will enhance any PCR reaction and should be considered in combination with other additives and/ or along with other modifications to cycling conditions. Thus, in order to calculate the optimal annealing temperature the following equation is employed: Та OPT = 0.3 Tм Primer + 0.7 Tм Product -14.9 Тм Primer is calculated as the Tм of the less stable pair using the equation: Тм Primer = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273.15 + 16.6 log[K + ] Where ΔH is the sum of the nearest neighbor enthalpy changes for hybrids ΔS is the sum of the nearest neighbor entropy changes R is the Gas Constant (1.99 cal K-1 mol-1) C is the primer concentration and [K + ] is the potassium concentration. The latter equation can be computed using one of the Tм calculators listed at the following website: http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html Tм Product is calculated as follows: Tм Product = 0.41(%G-C) + 16.6 log [K + ] - 675/product length For most PCR reactions the concentration of potassium ([K + ]) is going to be 50 mM.

Hot start PCR is a versatile modification in which the initial denaturation time is increased dramatically (Таблица 4). This modification can be incorporated with or without other modifications to cycling conditions. Moreover, it is often used in conjunction with additives for temperamental amplicon formation. In fact, hot start PCR is increasingly included as a regular aspect of general cycling conditions. Hot start has been demonstrated to increase amplicon yield, while increasing the specificity and fidelity of the reaction. The rationale behind hot start PCR is to eliminate primer-dimer and non-specific priming that may result as a consequence of setting up the reaction below the Tм. Thus, a typical hot start reaction heats the sample to a temperature above the optimal Tм, at least to 60 ଌ before any amplification is able to occur. In general, the DNA polymerase is withheld from the reaction during the initial, elongated, denaturing time. Although other components of the reaction are sometimes omitted instead of the DNA polymerase, here we will focus on the DNA polymerase. There are several methods which allow the DNA polymerase to remain inactive or physically separated until the initial denaturation period has completed, including the use of a solid wax barrier, anti-DNA polymerase antibodies, and accessory proteins. Alternatively, the DNA polymerase may simply be added to the reaction after the initial denaturation cycle is complete.

Touchdown PCR (TD-PCR) is intended to take some of the guess work out of the Tм calculation limitations by bracketing the calculated annealing temperatures. The concept is to design two phases of cycling conditions (Таблица 5). The first phase employs successively lower annealing temperatures every second cycle (traditionally 1.0 ଌ), starting at 10 ଌ above and finishing at the calculated Tм or slightly below. Phase two utilizes the standard 3-step conditions with the annealing temperature set at 5 ଌ below the calculated Tм for another 20 to 25 cycles. The function of the first phase should alleviate mispriming, conferring a 4-fold advantage to the correct product. Thus, after 10 cycles, a 410-fold advantage would yield 4096 copies of the correct product over any spurious priming.

Stepdown PCR is similar to TD-PCR with fewer increments in the first phase of priming. As an example, the first phase lowers annealing temperatures every second cycle by 3 ଌ, starting at 10 ଌ above and finishing at 2 ଌ below the calculated Tм. Like TD-PCR, phase two utilizes the standard 3-step conditions with the annealing temperature set at 5 ଌ below the calculated Tм for another 20 to 25 cycles. This would allow the correct product a 256-fold advantage over false priming products.

Slowdown PCR is simply a modification of TD-PCR and has been successful for amplifying extremely G-C rich (above 83%) sequences (Table 6). The concept takes into account a relatively new feature associated with modern thermal cyclers, which allows adjustment of the ramp speed as well as the cooling rate. The protocol also utilizes dc 7 GTP to reduce 2 °structure formation that could inhibit the reaction. The ramp speed is lowered to 2.5 ଌ s -1 with a cooling rate of 1.5 ଌ s -1 for the annealing cycles. The first phase starts with an annealing temperature of 70 ଌ and reduces the annealing temperature by 1 ଌ every 3 rounds until it reaches 58 ଌ. The second phase then continues with an annealing temperature of 58 ଌ for an additional 15 cycles.

Nested PCR is a powerful tool used to eliminate spurious products. The use of nested primers is particularly helpful when there are several paralogous genes in a single genome or when there is low copy number of a target sequence within a heterogeneous population of orthologous sequences. The basic procedure involves two sets of primers that amplify a single region of DNA. The outer primers straddle the segment of interest and are used to generate PCR products that are often non-specific in 20 to 30 cycles. A small aliquot, usually about 5 μl from the first 50 μl reaction, is then used as the template DNA for another 20 to 30 rounds of amplification using the second set of primers that anneal to an internal location relative to the first set.

Other PCR protocols are more specialized and go beyond the scope of this paper. Examples include RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR, and RT-PCR.

13. Representative Results

Representative PCR results were generated by following the basic PCR protocols described above. The results incorporate several troubleshooting strategies to demonstrate the effect of various reagents and conditions on the reaction. Genes from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae and from an uncharacterized Mycobacteriophage were amplified in these experiments. The standard 3-step PCR protocol outlined in Table 2 was employed for all three experiments described below.

Before setting up the PCR experiment, the genomic DNA from both С. cerevisiae and the Mycobacteriophage were quantified and diluted to a concentration that would allow between 10 4 and 10 7 molecules of DNA per reaction. The working stocks were prepared as follows. A genomic yeast DNA preparation yielded 10 4 ng/μl. A dilution to 10 ng/μl was generated by adding 48 μl into 452 μl of TE pH 8.0 buffer. Поскольку С. cerevisiae genome is about 12.5 Mb, 10 ng contain 7.41 X 10 5 molecules. The genomic Mycobacteriophage DNA preparation yielded 313 ng/μl. A dilution to 2 ng/μl was generated by adding 6.4 μl into 993.6 μl of TE pH 8.0 buffer. This phage DNA is about 67 Kb. Thus, 1 ng contains 2.73 X 10 7 molecules, which is at the upper limit of DNA generally used for a PCR. The working stocks were then used to generate the Master Mix solutions outlined in Table 7. Experiments varied cycling conditions as described below.

В Рисунок 3а, genomic DNA from С. cerevisiae was used as a template to amplify the GAL3 gene, which encodes a protein involved in galactose metabolism. The goal for this experiment was to determine the optimal Mg 2+ concentration for this set of reagents. No MgCl2 was present in the original PCR buffer and had to be supplemented at the concentrations indicated with a range tested from 0.0 mM to 5.0 mM. As shown in the figure, a PCR product of the expected size (2098 bp) appears starting at a Mg 2+ concentration of 2.5 mM (lane 6) with an optimal concentration at 4.0 mM (lane 9). The recommended concentration provided by the manufacturer was 1.5 mM, which is the amount provided in typical PCR buffers. Perhaps surprisingly, the necessary concentration needed for product formation in this experiment exceeded this amount.

A different DNA template was used for the experiment presented in Рисунок 3b. Genomic DNA from a Mycobacteriophage was used to amplify a conserved 566 bp DNA segment. Like the previous experiment, the optimal Mg 2+ concentration had to be determined. Как показано в Рисунок 3b, amplification of the desired PCR product requires at least 2.0 mM Mg 2+ (lane 5). While there was more variability in the amount of product formed at increasing concentrations of MgCl2, the most PCR product was observed at 4 mM Mg 2+ (lane 9), the same concentration observed for the yeast GAL3 gene.

Notice that in the experiments presented in Figures 3A and 3B, a discrete band was obtained using the cycling conditions thought to be optimal based on primer annealing temperatures. Specifically, the denaturation temperature was 95 ଌ with an annealing temperature of 61 ଌ, and the extension was carried out for 1 minute at 72 ଌ for 30 cycles. The final 5 minute extension was then done at 72 ଌ. For the third experiment presented in Рисунок 3c, three changes were made to the cycling conditions used to amplify the yeast GAL3 gene. First, the annealing temperature was reduced to a sub-optimal temperature of 58 ଌ. Second, the extension time was extended to 1 minute and 30 seconds. Third, the number of cycles was increased from 30 to 35 times. The purpose was to demonstrate the effects of sub-optimal amplification conditions (i.e., reducing the stringency of the reaction) on a PCR experiment. Как показано в Рисунок 3c, what was a discrete band in Рисунок 3а, becomes a smear of non-specific products under these sub-optimal cycling conditions. Furthermore, with the overall stringency of the reaction reduced, a lower amount of Mg 2+ is required to form an amplicon.

All three experiments illustrate that when Mg 2+ concentrations are too low, there is no amplicon production. These results also demonstrate that when both the cycling conditions are correctly designed and the reagents are at optimal concentrations, the PCR experiment produces a discreet amplicon corresponding to the expected size. The results show the importance of performing PCR experiments at a sufficiently high stringency (e.g., discreet bands versus a smear). Moreover, the experiments indicate that changing one parameter can influence another parameter, thus affecting the reaction outcome.

Таблица 1. PCR reagents in the order they should be added.

*Units may vary between manufacturers

** Add all reagents to the Master Mix excluding any in need of titration or that may be variable to the reaction. The Master Mix depicted in the above table is calculated for 11 reactions plus 2 extra reactions to accommodate pipette transfer loss ensuring there is enough to aliquot to each reaction tube.

& # x000a0Standard 3-step PCR Cycling& # x000a0
Cycle stepТемператураВремяNumber of Cycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ 5 ଌ below Tм 70 ଌ to 80 ଌ 10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 минут1
Держать*4 ଌ1

Таблица 2. Standard 3-step PCR Cycling.

* Most thermal cyclers have the ability to pause at 4ଌ indefinitely at the end of the cycles.

& # x000a02-step PCR Cycling& # x000a0
Cycle stepТемператураВремяNumber of Cycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation Annealing/Extension94 ଌ 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 минут1

Таблица 3. 2-step PCR Cycling.

& # x000a0Hot Start PCR Cycling& # x000a0
Cycle stepТемператураВремяЦиклы
Initial Denaturation60 ଌ to 95 ଌ5 minute then add DNA polymerase1
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ 5 ଌ below Tм 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 минут1

Таблица 4. Hot Start PCR Cycling.

& # x000a0Touchdown PCR Cycling& # x000a0
Cycle stepТемператураВремяЦиклы
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ X =10 ଌ above Tм 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 2
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ X-1 ଌ reduce 1 ଌ every other cycle 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 28
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ 5 ଌ below Tм 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 20-25
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 минут1

Таблица 5. Touchdown PCR Cycling.

& # x000a0Slowdown PCR Cycling& # x000a0
Cycle stepТемператураВремяЦиклы
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ X ଌ =10 ଌ above Tм 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 2
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ X-1 ଌ reduce 1 ଌ every other cycle 70 ଌ to 80 ଌ*10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 28
Denaturation Отжиг Расширение94 ଌ 5 ଌ below Tм 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 20-25
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 минут1

Table 6. Slowdown PCR Cycling.

*For slowdown PCR, the ramp speed is lowered to 2.5 ଌ s -1 with a cooling rate of 1.5 ଌ s -1 for the annealing cycles.

Таблица 7. Titration of Mg 2+ used in Рисунок 3.

Рисунок 1. Common problems that arise with primers and 3-step PCR amplification of target DNA. (a) Self-annealing of primers resulting in formation of secondary hairpin loop structure. Note that primers do not always anneal at the extreme ends and may form smaller loop structures. (b) Primer annealing to each other, rather than the DNA template, creating primer dimers. Once the primers anneal to each other they will elongate to the primer ends. (c) PCR cycles generating a specific amplicon. Standard 3-step PCR cycling include denaturation of the template DNA, annealing of primers, and extension of the target DNA (amplicon) by DNA polymerase.

Фигура 2. Ice bucket with reagents, pipettes, and racks required for a PCR. (1.) P-200 pipette, (2.) P-1000 pipette, (3.) P-20 pipette, (4.) P-10 pipette, (5.) 96 well plate and 0.2 ml thin walled PCR tubes, (6.) Reagents including Taq polymerase, 10X PCR buffer, MgCl2, sterile water, dNTPs, primers, and template DNA, (7.) 1.8 ml tubes and rack.

Рисунок 3. Example of a Mg 2+ titrations used to optimize a PCR experiment using a standard 3-step PCR protocol. а) С. cerevisiae Yeast genomic DNA was used as a template to amplify a 2098 bp GAL3 gene. In lanes 1 - 6, where the Mg 2+ concentration is too low, there either is no product formed (lanes 1-5) or very little product formed (lane 6). Lanes 7 - 11 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR experiment as indicated by the presence of the 2098 bp amplicon product. (b) An uncharacterized mycobacteriophage genomic DNA template was used to amplify a 566 bp amplicon. Lanes 1 - 4, the Mg 2+ concentration is too low, as indicated by the absence of product. Lanes 5 - 11 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR as indicated by the presence of the 566 kb amplicon product. (c) . С. cerevisiae Yeast genomic DNA was used as a template to amplify a 2098 bp GAL3 gene as indicated in panel a. However, the annealing temperature was reduced from 61 ଌ to 58 ଌ, resulting in a non-specific PCR bands with variable lengths producing a smearing effect on the agarose gel. Lanes 1 - 4, where the Mg 2+ concentration is too low, there is no product formed. Lanes 5 - 8 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR as seen by the presence of a smear and band around the 2098 kb amplicon product size. Lanes 9 - 11 are indicative of excessively stringent conditions with no product formed. (a-c) Lanes 12 is a negative control that did not contain any template DNA. Lane M (marker) was loaded with NEB 1kb Ladder.

Рисунок 4. Sterile tubes used for PCR. (1.) 1.8 ml tube (2.) 0.2 ml individual thin walled PCR tube, (3.) 0.2 ml strip thin walled PCR tubes and caps.

Рисунок 5. Thermal cycler. Closed thermal cycler left image. Right image contains 0.2 ml thin walled PCR tubes placed in the heating block of an open thermal cycler.


Useful Links

This is one of over 2,400 courses on OCW. Explore materials for this course in the pages linked along the left.

MIT OpenCourseWare is a free & open publication of material from thousands of MIT courses, covering the entire MIT curriculum.

No enrollment or registration. Freely browse and use OCW materials at your own pace. There's no signup, and no start or end dates.

Knowledge is your reward. Use OCW to guide your own life-long learning, or to teach others. We don't offer credit or certification for using OCW.

Made for sharing. Download files for later. Send to friends and colleagues. Modify, remix, and reuse (just remember to cite OCW as the source.)

About MIT OpenCourseWare

MIT OpenCourseWare is an online publication of materials from over 2,500 MIT courses, freely sharing knowledge with learners and educators around the world. Learn more »

© 2001&ndash2018
Массачусетский Институт Технологий

Your use of the MIT OpenCourseWare site and materials is subject to our Creative Commons License and other terms of use.


P OLYMERASE C HAIN R EACTION

Polymerase chain reaction (PCR) is a robust technique to selectively amplify a specific segment of DNA in vitro.[1] PCR is performed on thermocycler and it involves three main steps: (1) denaturation of dsDNA template at 92�ଌ, (2) annealing of primers at 50�ଌ, and (3) extension of dsDNA molecules at approx. 72ଌ. These steps are repeated for 30� cycles.

Various chemical components of PCR include MgCl2, buffer (pH: 8.3𠄸.8), Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), PCR primers, target DNA, and thermostable DNA polymerase.[2]

Target sequence is the sequence within the DNA template, which will be amplified by PCR.[2]

PCR primers are single-stranded DNA (usually 18� nucleotides long), which match the sequences at the ends of or within the target DNA, and these are required to start DNA synthesis in PCR.[2]


Advantages and limitations of PCR

There are multiple advantages to PCR. First, it is a simple technique to understand and to use, and it produces results rapidly (Bolognia et al, 2008). It is a highly sensitive technique with the potential to produce millions to billions of copies of a specific product for sequencing, cloning, and analysis. This is true of qRT-PCR as well, but qRT-PCR has the advantage of quantification of the synthesized product. Thus, it can be used to analyze alterations of gene expression levels in tumors, microbes, or other disease states.

Although PCR is a valuable technique, it does have limitations. Because PCR is a highly sensitive technique, any form of contamination of the sample by even trace amounts of DNA can produce misleading results (Bolognia et al, 2008 Smith & Osborn, 2009). In addition, in order to design primers for PCR, some prior sequence data is needed. Therefore, PCR can only be used to identify the presence or absence of a known pathogen or gene. Another limitation is that the primers used for PCR can anneal non-specifically to sequences that are similar, but not completely identical to target DNA. In addition, incorrect nucleotides can be incorporated into the PCR sequence by the DNA polymerase, albeit at a very low rate.


5. ELISA

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is a popular format of “wet-lab” type analytic biochemistry assay that uses a solid-phase enzyme immunoassay (EIA) to detect the presence of a substance, usually an antigen ( peptides, proteins, antibodies and hormones), in a liquid sample or wet sample.

ELISA involves the separation of specific and non-specific interactions (via serial binding to a solid surface, usually a polystyrene multi-well plate) and quantification through color change. The ELISA procedure results in a colored end product which correlates to the amount of analyte (substance under investigation) present in the original sample. Know more about ELISA.


The basics of gel electrophoresis

The purpose of gel electrophoresis or “running a gel” is to visualize whether or not your DNA extraction and/or subsequent PCR reaction actually worked. Although PCR is supposed to only amplify a single pure product, the reality is that you end up with a mix of primer-dimers (primers binding to each other instead of the template strand) and incorrect fragments in addition to your desired product. Gel electrophoresis is used to sort DNA fragments by size (number of base pairs). By comparing PCR products to a “ladder” or a set of known standard base pair lengths, you can estimate the length of the fragments from your PCR and look for one that matches the size of the product you were trying to amplify.

What you need
To do a gel electrophoresis, you will need the following items:

  1. Gel rig: this is a specialized piece of equipment for casting your gel and doing an electrophoresis.
  2. PCR product: this is the mixture of DNA fragments you want to sort.
  3. DNA ladder: a solution of DNA molecules of varying length that is used as a size reference.
  4. Buffer: this is used to make up the gel, maintains the pH, and contains the ions necessary to carry an electric charge.
  5. Agarose gel: this is a type of gelatin from seaweed that will separate the DNA fragments.
  6. Loading dye: this dye is added to the DNA sample to make it easier to handle.
  7. DNA stain: this dye binds to DNA so the bands can be seen in the transilluminator. Examples include SYBR Green, SYBR Safe, Ethidium Bromide, and Fast Blast.
  8. Transilluminator: this machine produces UV, blue, or white light which makes the DNA stain (and the DNA) glow. Different sources of light correspond to different stains.

Как это работает?
DNA molecules carry an overall negative charge. Since opposites attract, DNA is attracted to positive charges, in this case, the (+) electrode in the gel rig. To get to the (+) electrode, DNA has to travel through a sheet of agarose gel. Smaller pieces are able to travel through the gel faster than long pieces. Fragments of the same length travel at the same speed and form clear bands in the gel.

When the gel is finished running, it is soaked in a DNA Stain, a chemical that does two things: 1) bind to double-stranded DNA and 2) glow under UV, blue, or white light.
The resulting gel image should look something like this:

Note that there are 6 lanes on this gel. Lanes 1 and 6 contain a ladder that serves as a reference of measurement. The DNA or PCR product is in lanes 2-5 with resulting bands in lanes 2-4. Also note that the flow of electricity is from negative to positive.


Bring polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis into your classroom with the Taste of Genetics PTC MiniLab! This fun and engaging Mendelian genetics lab allows students to identify their phenotype for bitter taste and investigate their genotype for the bitter taste gene, TAS2R38. Students will extract their own DNA, amplify a region of interest of the gene, use a restriction digest assay to cut the DNA, then separate and visualize the fragments using electrophoresis to determine their genetic profile of the of their TAS2R38 alleles.

  • Teacher guide with background information, step-by-step procedures, questions for critical thinking, and sample answers for teachers
  • Hands-on lab that can be completed in three 50-minute class periods
  • Store at 4°C GreenGel™ Cups should be left in the original box and protected from light
  • Guaranteed stable for three months with proper storage

Teaching AP Biology? A Taste of Genetics MiniLab and extension activities are three Big Ideas in one comprehensive package. Together, these labs are an in-depth exploration of the TAS2R38 gene, covering hands-on genetic analysis, bioinformatics, population genetics, and evolution.

Materials Included in each MiniLab:

Each MiniLab contains enough materials for 10 workstations, 2 – 3 students per workstation.

  • Ten 2% Agarose GreenGel™ Cups
  • One bottle of 100 mL TBE buffer concentrate, enough to make 2L of 1X running buffer
  • DNA extraction solution
  • Forward and reverse primers for PTC genes
  • Taq polymerase master mix (2X)
  • HaeIII restriction enzyme
  • Restriction enzyme dilution buffer
  • MiniOne® Sample Loading Dye (5X)
  • MiniOne® Molecular Weight Marker
  • One bag of 0.2mL thin-walled PCR tubes
  • One bag of 0.65 mL microcentrifuge tubes
  • Forty PTC taste strips
  • Teacher guide

8.5: Lab Procedures- PCR and Gel Electrophoresis - Biology

This inexpensive, safe, equipment was developed by the NCBE so that school students could carry out gel electrophoresis with DNA and proteins. It was awarded the coveted Millennium Product status by the Design Council in 2000.

ABOUT GEL ELECTROPHORESIS

Gel electrophoresis is a key technique in modern biology that features in all the new A Level Biology specifications in England. It is a way of separating DNA, RNA or proteins based on their size and the electrical charge on the molecules.

Как это работает
First, a gel is cast from agarose a very pure form of agar, which is obtained from seaweed. At one end of the slab of gel are several small wells, made by the teeth of a comb that was placed in the molten agarose before it set. A buffer solution is poured over the gel, so that it fills the wells and makes contact with the electrodes at each end of the gel. Ions in the buffer solution conduct electricity. The test samples (DNA fragments) are mixed with a small volume of loading dye. This dye is dissolved in a dense sugar solution, so that when it is added to the wells, it sinks to the bottom, taking the sample with it. An electrical potential is applied across the gel. Phosphate groups give the DNA fragments a negative electrical charge, so that the DNA migrates through the gel towards the positive electrode. Small DNA fragments or proteins move quickly through the porous gel larger molecules travel more slowly. In this way the pieces of DNA or proteins are separated by size. The loading dye also moves through the gel, so that the progress of the electrophoresis can be seen (the DNA itself is invisible).

Electrophoresis kits and related items

The NCBE currently supplies four different practical protocols for gel electrophoresis.

ELECTROPHORESIS KITS

Related equipment

OTHER ITEMS

GENERAL SAFETY ADVICE

Visualising DNA
After electrophoresis, the DNA is visualised. In research laboratories, a fluorescent dye will have been incorporated into the agarose gel before it was cast. After the gel has been ‘run’ it is illuminated with ultraviolet (UV) light and the dye, which binds to DNA, will show up as bright fluorescent bands. Ethidium bromide is a dye that until recently was most commonly used for staining DNA. Ethidium bromide and its breakdown products are thought to be potent mutagens and carcinogens and therefore it should not be used in schools . Ethidium bromide has similar dimensions to a base pair in DNA. When ethidium bromide binds to DNA, it slips between adjacent base pairs and stretches the double helix. This explains the dye’s mutagenic effect — the ‘extra bases’ cause errors (frameshift mutations) when the DNA replicates. In addition, short-wavelength UV light (which itself is harmful) is required for ethidium bromide to fluoresce and reveal the DNA. For reasons of safety and because UV light of this wavelength causes unwanted mutations in the DNA being studied, several alternative stains are now commonly used in labs. Это включает SYBRsafe а также GelRed , which although they are thought to be safer than ethidium bromide, are far more expensive [Ethidium bromide costs £4.50 per mL compared with £133 per mL for SYBRsafe and £200 per mL for GelRed (2016 prices).]

In schools, safer, cheaper dye solutions are used to stain the entire gel after electrophoresis. Suitable stains include Azure A and Azure B, Toluidine blue O and Nile blue sulphate. This type of stain is not thought to intercalate within the DNA double helix, but instead binds ionically to the negatively-charged phosphate groups of the DNA.

Polyacrylamide gels and protein electrophoresis
If you wish to separate very small DNA molecules or proteins, gels cast from polyacrylamide are sometimes used. Note: For safety reasons, polyacrylamide gels should not be cast in schools: the acrylamide use to make the gels is a neurotoxin. (You can use pre-cast gels if you wish, but they have a limited shelf life.)

It is possible to separate proteins using a special type of agarose, but in contrast to the procedure using polyacryamide, the proteins are separated by charge only (not charge and size). This is because the pores within the agarose gel are relatively large and the proteins can easily pass through them.

As with DNA, the proteins on the gel are stained with an appropriate dye such as Coomassie blue.

UNIQUE, AWARD-WINNING, SAFE, TECHNOLOGY

The enzymes and DNA in the NCBE's award-winning kits are dried. These reagents can be transported and stored at room temperature instead of the -20 °C that is normally required for such delicate biological molecules. To dispense small volumes of reagents with the required precision, the NCBE has coupled special microsyringes with calibrated tips, providing a low-cost yet highly accurate alternative to conventional micropipettes. The NCBE's gel electrophoresis apparatus uses carbon fibre electrodes rather than the platinum that is normally used. The equipment is powered by low-voltage batteries or an inexpensive, safe and effective 36 volt mains transformer. To stain the DNA on the gel the kits use Toluidine Blue O in preference to fluorescent stains and ultraviolet light. If a special agarose is used, proteins can also be separated using this equipment and stained with Colloidal Coomassie Blue.

THE POLYMERASE CHAIN REACTION

The polymerase chain reaction (PCR) is one of the most important and powerful methods in molecular biology. It enables millions of copies of specific DNA sequences to be made easily and quickly. The technique and variations of it are used extensively in medicine, in molecular genetics and in pure research. The PCR and plant evolution module provides materials for the simple extraction of chloroplast DNA from plant tissue, its amplification by the PCR, and gel electrophoresis of the PCR product. Students can use plants of their choice and identify possible evolutionary relationships between different species. This mirrors the molecular methods used in modern plant taxonomy. This activity presents an ideal opportunity for open-ended investigations by individual students or groups.


Смотреть видео: Методы молекулярной биологии. Электрофорез в агарозном геле (December 2022).