Информация

Что такое утечка протонов?

Что такое утечка протонов?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

У меня есть некоторое представление об этом. Является ли это бесполезным обратным потоком ионов H + из-за разобщения белков во время аэробного дыхания?

Спасибо


Короткий ответ: да. Это также включает неспецифическую утечку без помощи разобщающих белков, поскольку внутренняя мембрана митохондрий не полностью непроницаема для протонов. Например, протоны могут падать назад через комплексы, перекачивающие протоны, через другие носители растворенных веществ или через другие отверстия или неровности в мембране.


Регуляция и физиология утечки митохондриальных протонов

Митохондрии соединяют дыхание с синтезом АТФ через электрохимический протонный градиент. Утечка протонов через внутреннюю мембрану позволяет регулировать эффективность связи. Этот обзор преследует три цели: 1) познакомит незнакомого читателя с утечкой протонов и ее физиологическим значением, 2) рассмотреть роль и регуляцию разобщающих белков, а также 3) обрисовывают перспективы утечки протонов как средства лечения ожирения, диабета и возрастных заболеваний.


Активные формы кислорода в митохондриях опосредуют активацию эндотелиальных клеток, индуцированную лизофосфатидилхолином

Задача: Вызванная гиперлипидемией активация эндотелиальных клеток (ЭК) рассматривается как начальное событие, ответственное за рекрутирование моноцитов в атерогенезе. Однако остается плохо определенным механизм, лежащий в основе активации ЭК, вызванной гиперлипидемией. Здесь мы проверили новую гипотезу о том, что митохондриальные активные формы кислорода (mtROS) служат сигнальными медиаторами для активации ЭК при раннем атеросклерозе.

Подход и результаты: Метаболомический и транскриптомический анализ показал, что несколько видов лизофосфатидилхолина (LPC), таких как 16: 0, 18: 0 и 18: 1, и их процессирующие ферменты, включая Pla2g7 и Pla2g4c, значительно индуцировались в аортах мышей с нокаутом аполипопротеина E. ранний атеросклероз. Используя электронно-спиновый резонанс и проточную цитометрию, мы обнаружили, что LPC 16: 0, 18: 0 и 18: 1 индуцировали mtROS в первичных ЭК аорты человека, независимо от активности никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазы. Механически, используя конфокальную микроскопию и митохондриальный анализатор Seahorse XF, мы показали, что LPC индуцирует mtROS через уникальное опосредованное проникновением кальция увеличение утечки протонов и уменьшение митохондриального O2. Кроме того, мы обнаружили, что mtROS способствует LPC-индуцированной активации ЭК, регулируя ядерное связывание активаторного белка-1 и индуцируя экспрессию гена молекулы-1 межклеточной адгезии in vitro. Кроме того, мы показали, что ингибитор mtROS MitoTEMPO подавлял активацию ЭК и рекрутирование моноцитов аорты у мышей с нокаутом аполипопротеина E с использованием методов прижизненной микроскопии и проточной цитометрии.

Выводы: Несвязанный с синтезом АТФ, но связанный с утечкой протонов, увеличение mtROS опосредует LPC-индуцированную активацию ЭК во время раннего атеросклероза. Эти результаты показывают, что митохондриальные антиоксиданты являются многообещающим средством лечения сосудистых воспалений и сердечно-сосудистых заболеваний.

Ключевые слова: атеросклероз эндотелиальных клеток гиперлипидемия митохондрии реактивные формы кислорода.


Полученные результаты

Подход

Концептуально, все три протон-транслоцирующих комплекса дыхательной цепи (рис. 1) функционируют одинаково, хотя детальные молекулярные механизмы сильно различаются. Во всех случаях мы имеем дело с энергетически восходящей, эндергонической или «управляемой» реакцией транслокации протонов с отрицательно заряженной N-стороны на положительно заряженную P-сторону внутренней митохондриальной мембраны (определяемой здесь как реакция 1). Такая реакция не может происходить спонтанно, но становится возможной в сочетании с энергетически нисходящей, экзергонической или «движущей» реакцией (реакция 2), которая представляет собой окисление НАДН убихиноном (катализируемое комплексом I), окисление убихинола феррицитохромом. c (катализируемый комплексом III) или окисление ферроцитохрома c кислородом (катализируемым комплексом IV) или любой комбинацией этих трех функций (рис. 1).

Протонодвижущие комплексы I, III и IV изображены на внутренней мембране вместе с дополнительными компонентами цепи, комплексом II, цитохромом. c и убихинон (Q), доноры водорода НАДН и сукцинат и акцептор, O2. Комбинация N, N, N ’, N’-тетраметил-фенилендиамина (TMPD) и аскорбата (не показана для ясности, см. Текст) отдает электроны непосредственно цитохрому. c и, таким образом, задействует только комплекс IV. Черные стрелки показывают перенос водорода и электронов в цепи, в конечном итоге снижая O2 к воде. Красные стрелки символизируют связанные протонодвижущие события, где Zп - эффективная протонодвигательная H + / e - стехиометрия, 2 для комплекса I и комплекса IV, 1 для комплекса III (см. «Методы») и n - название комплекса. Типичные средние разности окислительно-восстановительных потенциалов (ΔE) по каждому комплексу. Чистое изменение свободной энергии (Δграмм) для любой комбинации комплексов дается как арифметическая сумма соответствующей разности окислительно-восстановительных потенциалов и протонодвижущей силы (Δп), умноженное на H + / e - стехиометрию (Z), где ΔE имеет отрицательный знак и больше Δп для случая, когда окислительно-восстановительная химия управляет перемещением протонов.

Рассматривая это на общем уровне термодинамики неравновесных связанных реакций, можно написать (см. Ссылки 14,15,16)

куда J1 а также J2 - потоки сопряженных реакций, а Икс1 а также Икс2 относятся к соответствующим силам (свободным энергиям). В случае комплексов электронно-транспортной цепи это становится:

куда JЧАС - поток протонов (отрицательный, когда протоны перекачиваются с N на P-сторону мембраны), Jе - поток электронов, Δп - протонодвижущая сила, ΔE представляет собой окислительно-восстановительный интервал или разность окислительно-восстановительного потенциала окислительно-восстановительных носителей на донорной и акцепторной сторонах рассматриваемой реакции. Коэффициенты перекрестной связи L12 а также L21 считаются равными, так называемая симметрия Онзагера, которая соблюдается при многих условиях окислительного фосфорилирования (см. ссылки 15,16 и ниже). Для насоса, L11 а также L22 отрицательны, и L12 а также L21 положительные.

Важно отметить, что наша трактовка митохондриальной окислительно-восстановительной транслокации протонов уравнениями 1 является упрощением, поскольку поток протонов, JЧАС, будет оцениваться по потоку протонов через Fо часть АТФ-синтазы, ведущая к синтезу АТФ (см. ниже). Уравнение (1b) явно не включает поток протонов через диэлектрик мембраны (утечка протонов). Такая утечка протонов, а также неполная связь между электронами и протонами в самих респираторных комплексах (т.е. «проскальзывание» протонов или электронов, см. Ссылки 7,8,9,10,11,12,13,17 и рис. 2) , вместо этого вместе рассматриваются в «степени связи» (q) реакций 1 и 2, как будет определено ниже.

На рисунке показан прототип протон-двигательного окислительно-восстановительного комплекса дыхательной цепи (слева) и схематический вид F1Fо АТФ-синтаза (справа), оба встроены во внутреннюю фосфолипидную мембрану митохондрий. Красные стрелки показывают перенос электронов от восстановителя к окислителю, либо связанный (Jе п ) к перекачке протонов через мембрану (JЧАС п ) или оторванным от него («проскальзывание электронов», Jе S ). JЧАС L изображает внутреннюю утечку протонов в механизме накачки («проскальзывание протонов»). JЧАС M означает потерю протонодвижущей силы за счет протекания протона через мембрану. Приток протонов через Fо домен АТФ-синтазы (JЧАС F ) предполагается, что он полностью связан с синтезом АТФ без значительных сдвигов (см. текст). Стехиометрические аспекты (отношения H + / e - и H + / ATP) опущены для ясности (но см. Текст).

Определение соотношений выходных и входных сил и потоков как Икс (= Δп/ ΔE) а также j (=JЧАС/ Дже) соответственно, и механистическая H + / e - стехиометрия, Z, как квадратный корень из отношения между первичными коэффициентами связи потока / силы, т. е. Z = √ (L11/ Л22), можно получить из уравнения. (1) 14,15,16

куда q дан кем-то:

Фактор q называется степенью связи между процессами ввода и вывода 14 и варьируется от 0 (нет связи) до 1 (полная связь). При полном сочетании двух реакций (т. Е. q = 1) магнитный поток j равно −Z.

Соотношение j/Z, что эквивалентно (H + / e -) /Z, была названа «стехиометрической эффективностью» 18, которую не следует путать с термодинамической эффективностью (см. ниже). j/Z также не эквивалентно степени связи (q), за исключением особого случая, когда Икс = 0, т.е. когда сила ведомой реакции равна нулю (Δп = 0), и сопряженная реакция протекает без нагрузки (см. Уравнение (2)). Этот особый случай был назван «поток по уровню» 14,15,16 и является условием, к которому обычно стремятся большинство методов определения отношения H + / e экспериментально (но см. Ниже). Примечательно, что такое экспериментально полученное отношение H + / e - (j) на уровне потока не равна истинной механистической стехиометрии (Z), но на это значение, умноженное на степень связи, т. е. qZ.

Фокус

Одна из целей данной работы - оценить термодинамическую эффективность окислительно-восстановительной транслокации протонов. Поскольку термодинамический КПД (η) определяется как отношение между выходной и входной мощностями двух связанных реакций, а поскольку мощность является произведением магнитного потока (J) и сила (Икс) мы можем написать

где отрицательный знак означает, что ведомый поток реакции (JЧАС) происходит в направлении против сопряженной силы (Δп), то есть в чистом потоке протонов преобладает накачка, а не утечка. Из более ранних определений соотношений расхода и силы (j а также Икс) это уравнение упрощается до

Таким образом, термодинамический КПД (η) всей транспортной цепи электронов приближается к нулю в митохондриях Состояния 4, потому что накачка протонов равна утечке протонов, так что суммарный поток протонов (J F ЧАС, Рис.2) стремится к нулю. Тем не менее, каждый отдельный комплекс протонной накачки может все еще работать с высокой эффективностью в Состоянии 4, но энергия, передаваемая протонными насосами, рассеивается за счет утечки через мембрану. В полностью несвязанном состоянии, также называемом потоком уровня 14,15,16, протонодвижущая сила (т.е. выходная энергия, Икс1) стремится к нулю и, следовательно, η также равен нулю. Ясно, что максимальная эффективность общей реакции достигается где-то между статическим напором и уровнем потока (рис. 3, подробности см. Ниже). В математической модели протонного насоса цитохрома c оксидазы, Ким и Хаммер 19 обнаружили очень похожую колоколообразную зависимость термодинамической эффективности от протонодвижущей силы, что и теоретическая, показанная на рис.

На рисунке показана зависимость КПД (η) от отношения выходной (протонодвигательной) к входной (окислительно-восстановительной) сил, нормированной механистической (идеальной) H + / e - стехиометрией (Z) (см. также ссылку 14), согласно формуле. (4), для четырех различных степеней сцепления (q), как определено формулой. (7). Примеры кривых приведены только для «восходящего» случая, когда окислительно-восстановительная реакция приводит к перемещению протонов. Тонкие синие линии показывают приблизительный диапазон соотношений сил и эффективности, наблюдаемых в Состоянии 3 изолированных митохондрий печени крысы (см. Таблицу 1). Область, охватываемая данными, обозначена синим прямоугольником.

Состояние 3, где избыток АДФ и неорганического фосфата (Pя) поддерживает высокую скорость дыхания 6 и сопутствующий синтез АТФ, управляемый Δп, находится между статическим напором и уровнем потока и, следовательно, является единственным достаточно четко определенным состоянием изолированных митохондрий, пригодным для определения термодинамической эффективности.

Определение эффективности с помощью уравнения. (5) требует знания отношения сил в Состоянии 3 (Икс), который может быть рассчитан из литературных данных, где окислительно-восстановительный баланс NAD + / NADH, убихинона / убихинола, ферри- / ферроцитохрома c и окислительно-восстановительные пары кислород / вода были зарегистрированы 20. Однако коэффициент магнитного потока (j) (т.е. отношение H + / e -) не может быть непосредственно измерено в Состоянии 3. К счастью, у нас есть доступ к метаанализу количества АТФ, образованного на переносимые электроны (так называемый ATP / 2e - или P / O ratio) в различных доменах дыхательной цепи митохондрий в состоянии 3 21. Такие данные ATP / 2e - могут быть преобразованы в отношения H + / 2e - (которые в два раза больше коэффициентов потока j) с помощью соотношения

где H + / ATP, то есть количество протонов, перемещенных с P-стороны на N-сторону внутренней мембраны на одну синтезированную молекулу АТФ, составляет 3,67 в митохондриях животных в случае внемитохондриального продуцирования АТФ. Благодаря восьми субъединицам с мембранной кольцевой структуры АТФ-синтазы в митохондриях животных, восемь протонов перемещаются за полный оборот с последующим синтезом трех молекул АТФ 22, давая 8/3 или 2,67 H + / ATP. Дальнейшая транслокация образовавшегося АТФ во внемитохондриальное пространство в обмен на АДФ и Pя в противоположном направлении происходит на АДФ / АТФ и фосфатных носителях, соответственно, в обмен на перемещение еще одного протона 22.

Важно отметить, что коэффициент магнитного потока, j, оцениваемый этим методом, измеряет только производительный поток протонов, используемый для синтеза АТФ (см. рис. 2 и ниже).

Чтобы получить степень сцепления (q) в митохондриях Состояния 3 недостаточно знать механистическую стехиометрию (Z) и H + / e - отношением (j). Как уже упоминалось выше, q = j/Z только в частном случае, когда нет нагрузки, т.е. когда Икс = 0. Митохондрии состояния 3 не работают на уровне потока (Δп = 0), но при значительном соотношении сил (Икс) Δп часто составляет ок. 170 мВ 7,8,9,10,13,23. Таким образом, необходимо решить уравнение. (3) относительно q, уступая

Хотя степень сцепления (q) может считаться константой в этой трактовке, отношение H + / e - (т. е. отношение потоков j) нет, но уменьшается с увеличением нагрузки (Икс) от его максимального значения qZ при нулевой нагрузке 14,15,16.

Термодинамическая эффективность

В таблице 1 показаны данные, полученные для трех окислительно-восстановительных комплексов в изолированных митохондриях в состоянии 3, работающих вместе или оцениваемых по отдельности (см. «Методы»). Для сравнения трех окислительно-восстановительных комплексов соотношение сил (Икс) нормируется умножением на механистическую H + / e - стехиометрию, Z, который равен 2, 1 и 2 соответственно для комплексов I, III и IV (см. «Методы»), а коэффициент потока (j) нормируется делением на Z. Данные для индивидуальных комплексов были получены следующим образом (см. Рис. 1). ATP / 2e - для комплекса I принимали как разницу между средними соотношениями с NADH-связанными субстратами и сукцинатом. Соотношение для комплекса IV было основано на среднем ATP / 2e - с TMPD + аскорбатом в качестве субстрата. Соотношение для комплекса III было основано на разнице между отношениями ATP / 2e - с сукцинатом и TMPD + аскорбатом в качестве субстратов.

Как показано в таблице 1, расчетная термодинамическая эффективность (η) варьируется между

67 и 87%, наивысший из которых - эффективность комплекса I. Для комплекса IV приведены два набора данных, которые объясняются в следующем разделе.

Частный случай комплекса IV (цитохром c оксидаза)

Традиционная обработка данных комплекса IV (таблица 1, данные в скобках) показывает, что конечный фермент дыхательной цепи будет иметь самую низкую эффективность преобразования энергии, 67%, по сравнению с эффективностями комплекса III (78%) и комплекс I (87%). Можно подозревать, что это связано с тем, что общая реакция комплекса IV необратима, так что образование O2 из воды невозможно, так как движущая сила протона. Однако выяснение механизма катализа комплекса IV 1,24 показало, что необратимость является результатом необратимого расщепления связи O – O на стадии частичной реакции из-за большой Δграмм 0, где связанный с кислородом промежуточный продукт A превращается в промежуточный продукт P (см. Ссылку 25, рис. 4), реакция, которая не связана ни с перекачкой протонов, ни с трансмембранным переносом электронов или протонов 1,24. Связывание O2 к промежуточному соединению R полностью обратимо 26,27, и, что наиболее важно, все другие четыре частичные реакции каталитического цикла связаны с транслокацией протона 1,24, и действительно было показано, что они обращаются протон-движущей силой 28.

Биядерный центр показан в виде прямоугольника, состоящего из гема. а3 (Fe) близлежащая CuB (Cu) и консервативный тирозин (тир-ОН, тирозин-тир-O-, тирозинат-тир-O *, нейтральный тирозиновый радикал), ковалентно связанный с одним из трех гистидиновых лигандов CuB. Три гистидиновых лиганда CuB и проксимальный гистидин гема а3 не показаны для ясности. Название каждого промежуточного состояния находится за правым углом каждого прямоугольника. Красные стрелки указывают на реакции, каждая из которых включает перенос электрона на сайт от низкоспинового гема. а, чистый перенос протона одного субстрата с N-стороны мембраны для завершения химии восстановления кислорода, а также поглощение (с N-стороны) и высвобождение (на P-сторону) другого протона (т. е. перекачка протонов). Следовательно, красные стрелки указывают на частичные окислительно-восстановительные реакции, обратимые при высоких Δп. Синяя стрелка показывает стадию необратимой частичной реакции, на которой связь O – O в O2 нарушается в реакции, не связанной с передачей энергии. Обратите внимание, что классический промежуточный продукт «оксид железа» A 26 более точно описывается как состояние гема с супероксидом железа. а3 5 .

Необратимость общего цитохрома c Следовательно, оксидазную реакцию не следует рассматривать как свидетельство слабой связи окислительно-восстановительной химии с транслокацией протонов. Чтобы сфокусировать анализ на этих связанных стадиях реакции, мы вычли изменение свободной энергии необратимой стадии реакции A → P (рис. 4 примерно 5 ккал / моль 25) из общей стандартной движущей силы. В базовом анализе (таблица 1, данные в скобках) мы приняли среднюю концентрацию O2 120 мкМ при расчете движущей силы. Однако, как показали Wilson et al. 29, окислительно-восстановительный потенциал донора, цитохрома c, не понижен (цит. c не становится более сниженным) в устойчивом состоянии до тех пор, пока концентрация кислорода не опустится ниже ок. 10 мкМ. Поэтому мы скорректировали окислительно-восстановительный потенциал O2/ 2H2O соединяется с 12 мкМ O2 чтобы получить лучшую оценку истинной эффективности.Как показано в таблице 1, эти два изменения повышают термодинамический КПД с 67% до 77%, полностью за счет изменения соотношения сил. Мы пришли к выводу, что средняя термодинамическая эффективность реальных элементов протонной накачки комплекса IV (красные стрелки на рис. 4) вполне сопоставима с таковыми для других комплексов, и что более низкая общая эффективность функции комплекса IV вызвана необратимым шагом разрыва связи O – O, которая не связана с генерацией протонодвижущей силы.

Степень сцепления

В таблице 1 приведены результаты для степени сцепления (q) рассчитывается для состояния 3 в соответствии с формулой. (7). Здесь важно то, что степень сцепления очень высока для всех трех комплексов дыхательной цепи. q значительно превышает 0,99. Благодаря этому нормализованное отношение выходных / входных усилий (Zx) в Состоянии 3 дает хорошее приближение к термодинамической эффективности (см. уравнения (2) и (5)), что дает основание использовать это соотношение в качестве индикатора эффективности (например, ссылка 30). Степень связи довольно нечувствительна к протонодвижущей силе в Состоянии 3, которая здесь была принята равной 170 мВ (см. Выше). Если Δп были выше, степень связывания была бы даже выше, чем в таблице 1. Если бы она была 150 мВ, степень связывания для окисления сукцината (комплексы III + IV), например, упала бы только до 0,992.

Очень высокая степень сцепления (q & gt 0.99), найденные здесь по данным фосфорилирования (состояние 3) митохондрий, могут показаться резким контрастом с выводами, сделанными ранее на основе зависимости скорости дыхания митохондрий от мембранного потенциала. Например, Hinkle et al. 23 обнаружили, что скорость дыхания в Состоянии 4, измеренная при том же мембранном потенциале, что и в Состоянии 3 фосфорилирования, составляла значительную часть скорости дыхания в Состоянии 3. Потеря энергии, оцененная таким образом, составила почти 4% с сукцинатом в качестве субстрата. (активность комплекса III + IV) и

7% только для комплекса IV (см. Также «Обсуждение»). Однако наблюдаемые здесь отношения потоков (H + / e -) в Состоянии 3 составили 0,95–0,98 после нормализации к Z (Таблица 1), предполагая потери от утечек 2–5%, что согласуется с вышеупомянутыми данными. Следует подчеркнуть, что до тех пор, пока степень сцепления не идеальна (т.е. q & lt 1), коэффициент магнитного потока должен уменьшаться с увеличением отношения сил 14,15,16. Как уже было сказано выше, j равно qZ только в Икс = 0, т.е. на уровне потока, когда протонодвижущая сила равна нулю.

Сопряженные реакции протекают близко к равновесию.

Δграмм обозначает изменение свободной энергии связанной реакции транслокации протона, связанной с окислением-восстановлением, для любого из трех протонодвижущих комплексов или их комбинации, т.е.

Окислительно-восстановительный период для различных комплексов дыхательной цепи (X2, или ΔE) можно получить из литературы, как и раньше (Таблица 2 20,31). Для Состояния 3 мы приняли ПДС, равную 170 мВ (см. Выше), и это дает изменение свободной энергии прибл. −44 мВ для комплексов I и III, что соответствует

-1 ккал / моль, показывая, что даже в Состоянии 3 эти комплексы работают довольно близко к термодинамическому равновесию. Комплекс IV кажется менее обратимым, но если вычесть необратимое расщепление связи O – O и2 концентрации, приведенной к физиологическим уровням (см. выше), среднее изменение свободной энергии реакций, которые фактически управляют трансмембранным переносом протона, составляет всего лишь порядка -1,8 ккал / моль (-78 мВ).

Значения для Состояния 4 также перечислены в Таблице 2. В отсутствие экспериментального значения для Δп в экспериментах Мураока и Слейтера 20 мы оценили это следующим образом. Мы собрали случаи, когда дыхание изучали с сукцинатом и с TMPD + аскорбатом в качестве субстратов 20, где нет или очень ограничен суммарный поток электронов через комплекс I. Вместо этого генерируется Δп отгоняет электроны от цитохрома c и убихинон в НАД + до тех пор, пока не будет достигнуто стационарное состояние, в котором окислительно-восстановительные реакции комплекса I должны уравновеситься с Δп. В этих условиях мы обнаружили, что ΔE по комплексу I составила 373 и 374 мВ соответственно, т.е. соответствует Δп 187 мВ, что кажется очень хорошим приближением для изолированных митохондрий печени крысы в ​​присутствии 10 мМ неорганического фосфата 7,9. Используя это значение для Δп, мы обнаружили, что комплекс I действительно работает очень близко к термодинамическому равновесию в Состоянии 4 во время окисления НАД-связанных субстратов. Напротив, комплексы III и IV больше отклоняются от равновесия (см. Таблицу 2 ниже).

Постоянна ли степень связи?

Состояние 4 (статический напор) определяется как состояние, в котором чистое генерирование Δп (J1) исчезает. Если j равен нулю в уравнении. (2), то числитель правой части должен быть равен нулю, откуда следует, что отношение сил, Икс = Δп/ ΔE, является прямой функцией степени связи 14,15,16, так что

Это упрощение, потому что любая утечка протонов через мембрану 7, 8, 9, 10 обеспечит чистую генерацию Δп (J1) насосными комплексами по-прежнему происходит со скоростью, определяемой этой утечкой. Однако в хорошо связанных митохондриях утечка медленная по сравнению с прямым и обратным потоками в дыхательной цепи, так что окислительно-восстановительные реакции респираторных комплексов остаются довольно близкими к равновесию с протонодвижущей силой в Состоянии 4 и даже в Состоянии 3. (Таблица 2).

Применяя уравнение. (9) к данным состояния 4 (таблица 2) предполагает, что q составляет 0,99 для комплекса I, но только 0,84 и 0,90 для комплексов III и IV, соответственно, хотя последнее скорректировано с учетом необратимости расщепления связи O – O и оценено при 12 мкМ O2, как описано выше. Ценности q значительно меньше, чем 0,99, сообщалось ранее для изолированных митохондрий 15, но они также были основаны на формуле. (9) и состояние 4.

Этот результат предполагает близкий подход к термодинамическому равновесию между реакцией окисления-восстановления комплекса I и связанной с ней транслокацией протонов в Состоянии 4, и, таким образом, степень связывания близка к единице, как было обнаружено в Состоянии 3 (Таблица 1). Напротив, степень связывания для комплексов III и IV явно снижена по сравнению со значением, обнаруженным в состоянии 3, то есть во время активного окислительного фосфорилирования.


ИЗОЛИРОВАННЫЕ МИТОХОНДРИИ

Потоки: митохондриальный протонный ток (частота дыхания)

Измерение протонного тока обычно более информативно, чем измерение ПДС, если нужно измерить только один ток (но лучше знать оба). Точно так же более информативно знать ток, потребляемый вашей бытовой техникой из электросети, чем знать падение напряжения на вашем блоке электроснабжения.

Тесная связь между переносом электронов и вытеснением протонов как в митохондриях, так и в клетках [35–37] означает, что для данного субстрата скорость использования митохондриального кислорода является точной мерой общего протонного тока. Эта скорость измеряет активность одного процесса: перенос в комплексе IV четырех электронов на молекулу кислорода с образованием двух молекул воды. Несмотря на это очевидное ограничение, эксперименты могут быть разработаны для получения информации о широком спектре процессов, включая транспорт субстрата в клетку, цитоплазматический метаболизм, транспорт в митохондрии, митохондриальный метаболизм, доставку электронов в дыхательную цепь, активность комплекса I или II, комплекс III, комплекс IV, синтез АТФ, утечка протонов, экспорт АТФ в цитоплазму и утилизация АТФ в клетке. Искусство использования дыхания для выявления дисфункции в самых разных модулях и реакциях заключается в разработке экспериментов, которые передают контроль над этой реакцией, так что дисфункцию легче всего распознать и количественно оценить. Кислородный электрод Кларка используется в течение 50 лет для измерения митохондриального дыхания [38], но другие методы, такие как флуоресцентный анализ на планшете [39,40], могут предоставить ту же информацию.

Митохондриальный респираторный контроль: лучший общий показатель митохондриальной функции в изолированных митохондриях

Классические эксперименты с кислородным электродом для определения биоэнергетической функции митохондрий были разработаны Чансом и Уильямсом [38]. Субстрат добавляется в митохондриальную инкубацию, а затем небольшое количество АДФ, позволяя АТФ-синтазе функционировать, pmf уменьшаться и транспорт электронов ускоряться («состояние 3ADP’). Когда соотношение АТФ / АДФ приближается к равновесию, ПДС повышается, повторный вход протонов через синтазу прекращается и дыхание замедляется («состояние 4»). На практике присутствие АТФ в инкубации может иметь дополнительные эффекты в состоянии 4. Любая загрязняющая активность АТФазы (например, поврежденные митохондрии с несвязанными АТФазами или остаточные мышечные волокна в препарате митохондрий мышц) будет препятствовать восстановлению низкого дыхания. По этой причине укажите 3ADP дыхание может быть остановлено добавлением олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы, для достижения «состояния 4o» («состояние 4олигомицин’) Ставка, в которой рециркуляция АТФ не может внести свой вклад. За добавлением олигомицина может следовать тщательно оттитрованная концентрация протонофора, такого как FCCP (карбонилцианид п-трифторметоксифенилгидразон), чтобы обеспечить несвязанное дыхание (состояние 3FCCP»Или« состояние 3u »). В некоторых митохондриях, например, из бурого жира, где активность АТФ-синтазы очень ограничена, состояние 3u может быть намного выше, чем максимальное состояние 3ADP [41].

Два «прехемиосмотических» параметра все еще используются для количественной оценки поведения митохондрий в этом классическом эксперименте: митохондриальный RCR [отношение контроля дыхания (состояние 3 / состояние 4)], определяемое как дыхание в состоянии 3.ADP деленное на то, что в состоянии 4, и отношение P / O, моль синтезированного АТФ на моль O (1 /2О2) использовал. За редкими исключениями, такими как митохондрии бурого жира, разобщающий белок которых активируется жирной кислотой [42], «здоровые» митохондрии при правильно разработанных условиях инкубации демонстрируют высокий респираторный контроль: значительное увеличение частоты дыхания с помощью АДФ с последующим возвратом в состояние 4 Контроль дыхания митохондрий включает в себя основную функцию митохондрий: их способность бездействовать с низкой скоростью, но при этом реагировать на АДФ, производя АТФ с высокой скоростью. Высокий RCR означает, что митохондрии обладают высокой способностью к окислению субстрата и оборотом АТФ, а также низкой утечкой протонов. Однако не существует абсолютного значения RCR, которое могло бы диагностировать дисфункциональные митохондрии, поскольку значения зависят от субстрата и ткани. Контроль дыхания митохондрий - сложная функция, значение которой зависит от множества факторов, и эта сложность является ее главной сильной стороной: изменение почти любого аспекта окислительного фосфорилирования приведет к изменению RCR.

Состояние 3ADP примерно одинаково контролируется (в зависимости от ткани и условий) активностью обмена АТФ (в первую очередь адениннуклеотидтранслоказа, транспортер фосфата и АТФ-синтаза) и окислением субстрата (включая поглощение субстрата, процессирующие ферменты, соответствующие комплексы электронно-транспортной цепи, размеры пула UQ (убихинона) и цитохрома c, и [O2]) (Рисунок 2C). Ингибирование любого из этих процессов приведет к уменьшению степени состояния 3.

Состояние 3u контролируется исключительно окислением субстрата и выявляет дисфункцию в компонентах дыхательной цепи, субстратных транслоказах или дегидрогеназах. Различные субстраты позволяют исследовать несколько метаболических путей или респираторных комплексов.

Состояние 4 контролируется преимущественно утечкой протонов и любыми загрязняющими АТФазами, которые рециркулируют синтезированный АТФ в виде АДФ (и в небольшой степени за счет активности окисления субстрата) (рис. 2С).

Состояние 4o контролируется активностью утечки протонов (и приблизительно 10% окислением субстрата). Низкая скорость в состоянии 4o указывает на то, что митохондрии поддерживают достаточно высокую ПДС для ограничения транспорта электронов (см. Кривую «окисления субстрата» на Рисунке 2В, где ПДС должна быть & gt100–120 мВ для замедления скорости дыхания). Более высокий показатель состояния 4o указывает на измененную утечку протонов. in vivo или несоответствующие методы изоляции, которые вызывают искусственную утечку протонов.

Таким образом, RCR, либо состояние 3ADP/ состояние 4 или, в меньшей степени, состояние 3u / состояние 4о, сильно зависят от почти всех функциональных аспектов окислительного фосфорилирования, что делает их хорошими индикаторами дисфункции. Однако скорости очень чувствительны к ошибкам измерения, если используемая электродная система имеет значительную обратную диффузию кислорода из тефлоновой мешалки (которая может удерживать половину кислорода в суспензии) или из окружающей емкости или атмосферы. 4 ставки могут быть значительно занижены, что приводит к некоторым из очень высоких очевидных значений RCR, обнаруженных в литературе. Тест для этого состоит в том, чтобы повторить цикл состояние 3 / состояние 4, чтобы убедиться, что RCR остается неизменным при более низком давлении кислорода, или для полного подавления дыхания и проверки дрейфа вверх.

Субстраты, которые подают электроны в пул UQ, такие как сукцинат (и фосфат глицерина в соответствующих тканях), переносят меньше протонов на пару электронов, чем субстраты, связанные с НАДН, поэтому такая же скорость протонного цикла требует более высокой скорости дыхания. Это не влияет на RCR, так как состояние 3 и состояние 4 изменяются одинаково. Однако RCR имеет тенденцию быть ниже с этими подложками, потому что они создают более высокую ПДС по кинетическим и термодинамическим причинам. Поскольку скорость утечки протонов зависит от напряжения [22] (см. Кривую «утечки протонов» на рисунке 2B), это увеличивает скорость состояния 4 без изменения утечки протонов. Более того, при идентичных условиях инкубации можно увидеть очень разные RCR с митохондриями из разных тканей, что отражает разную кинетику окисления субстрата и разные физиологические роли утечки эндогенных протонов [43].

В заключение, соотношение респираторного контроля является единственной наиболее полезной общей мерой функции изолированных митохондрий. Высокий RCR указывает на хорошее функционирование, а низкий RCR обычно указывает на дисфункцию. Полезность RCR основывается на его сложности: практически любое изменение окислительного фосфорилирования изменит RCR. Если лечение не влияет на абсолютные показатели и RCR, можно с уверенностью утверждать, что в изолированных митохондриях не наблюдается общей биоэнергетической дисфункции. После того, как дисфункция в RCR была идентифицирована и определены ее непосредственные причины (было ли изменение скорости состояния 3 или степени 4?), Потребуются дальнейшие эксперименты для точного определения основных причин с использованием модульных кинетических анализов или анализов активности кандидатов.

Абсолютная частота дыхания может дать полезную информацию о механизме дисфункции.

Прямым индикатором функции изолированных митохондрий является их абсолютная частота дыхания, нормированная на белок или цитохром. а, в состоянии 3ADP или состояние 3у. Поврежденная цепь переноса электронов может быть неспособна поддерживать высокую скорость дыхания, если, например, значительное количество цитохрома c была потеряна из межмембранного пространства из-за повреждения внешней мембраны. Небольшие изменения абсолютной частоты дыхания могут быть вызваны изменениями чистоты, которые могут не иметь прямого отношения к митохондриальной дисфункции. После определения RCR абсолютная частота дыхания является полезным способом получить более полное представление о месте (ах) дисфункции: снижен ли респираторный контроль из-за более низкой скорости состояния 3u (дисфункция, локализованная в окислении субстрата) или только скорости состояния 3 ( дисфункция в синтезе АТФ), или из-за более высокой скорости состояния 4o (дисфункция протонной проводимости) или только степени 4 (дисфункция из-за загрязнения АТФазой)? Если состояние 3u низкое, оно низкое для всех субстратов (дефект комплекса IV) или только для определенных субстратов (например, комплекс II, если нарушено только окисление сукцината)?

Соотношение P / O: плохой репортер митохондриальной дисфункции

Отношение P / O - это максимальное количество молекул АТФ, образующихся при прохождении пары электронов по дыхательной цепи от субстрата к кислороду. Это стехиометрия дыхания H + / O, деленная на стехиометрию H + / ATP синтеза АТФ, и, таким образом, является механистической константой для любого конкретного субстрата. Его значение не изменится при дисфункции, если не будет изменен сам механизм связи (например, дыхательные комплексы проскальзывают и перекачивают меньше протонов, чем обычно). Литературные отчеты об изменении отношения P / O почти всегда отражают изменения в поправке на утечку протонов при изменении скоростей состояний 3 и 4, поэтому лучше сообщать эти скорости и RCR напрямую.

Эффективное соотношение P / O (или эффективность взаимодействия) - это эмпирическое значение, которое не делает поправки на утечку протонов, но сообщает об относительных потоках через АТФ-синтазу и пути утечки протонов [44]. Эффективность связи около состояния 4 чувствительна к изменениям протекания протонов и оборота АТФ и является полезной мерой в интактных клетках (см. Ниже).

Силы: митохондриальная ПДС

В электрическом аналоге протонной цепи кислородный электрод соответствует электросчетчику, отслеживающему общий ток, потребляемый приборами в доме: включите телевизор, и ток возрастет. Обычно мы не контролируем напряжение в сети отдельно, потому что падение напряжения при включении телевизора невелико. Эквивалентная переменная в протонном контуре, pmf, менее постоянна, немного снижается (на 10–20%) во время перехода в состояние 4–3 или когда накапливается Ca 2+, или немного увеличивается при увеличении подачи субстрата [45]. Мониторинг PMF, в идеале параллельно с дыханием, может помочь устранить двусмысленность. Например, лечение может увеличить дыхание в состоянии 4 за счет стимуляции разобщения или синтеза АТФ, или за счет увеличения доступности субстрата, pmf, контролируемый параллельно, может различать первое (деполяризация) и второе (гиперполяризация).

ПДС состоит из двух компонентов: мембранного потенциала (Δψм) и градиент pH (ΔpH) (уравнение 1). Хотя Δψм всегда доминирует, в экстремальных условиях (обедненные фосфатом митохондрии, накапливающие Ca 2+) ΔpH может составлять 50% PMF. Альтернативно, ΔpH равно нулю в среде на основе KCl в присутствии K + / H + ионофора нигерицина. Осторожное использование нигерицина упрощает эксперименты с изолированными митохондриями, позволяя приравнять pmf к Δψм, хотя для качественных исследований в присутствии фосфата изменение Δψм имеют тенденцию сопровождаться аналогичными, но меньшими изменениями ΔpH [45].

В отличие от клеточной электрофизиологии, где отдельные клетки могут быть закрыты или пронизаны электродами для прямого определения мембранного потенциала, косвенные методы должны использоваться для гораздо меньших митохондрий. Δψм оценивается путем мониторинга распределения мембранных перманентных одновалентных катионов (C +) между инкубационной средой и митохондриальным матриксом в соответствии с равновесием Нернста (уравнение 2):

Типичный Δψм значения 150–180 мВ соответствуют 300–1000-кратному накоплению. Логарифмическое соотношение в уравнении (2) означает, что сигналы чувствительны к небольшим изменениям потенциала, но что ошибки в оценке низких потенциалов могут быть большими.

Достаточно точные абсолютные значения Δψм может быть получен путем определения накопления катионов и объема матрицы с поправкой на кажущийся коэффициент активности катиона. Объем матрицы можно оценить, суспендировав митохондрии в среде, содержащей 3 H2O и [14 C] сахароза, центрифугирование и определение водопроницаемого и непроницаемого для сахарозы объема осадка [46]. Типичный объем составляет 0,5–1 мкл на мг митохондриального белка. Более удобно то, что кажущийся коэффициент связывания зонда часто зависит от объема матрицы, поэтому Δψм может быть рассчитан с использованием предварительно измеренной поправки на связывание, зависящей от объема, которая позволяет рутинно измерять Δψм без необходимости измерять объем матрицы или предполагать, что он остается постоянным во время эксперимента [47, 48].

Обычный метод контроля Δψм заключается в уравновешивании митохондриальных инкубаций с низкими концентрациями липофильных проницаемых через мембрану катионов, таких как TPP + (ион тетрафенилфосфония) или TPMP + (ион трифенилметилфосфония), а также для количественной оценки поглощения катионов по снижению средней концентрации, отслеживаемой внешним макроэлементом. -электрод [48,49]. Используются также постоянные на мембране катионы, которые обладают отличительной абсорбцией или флуоресценцией. Наиболее распространенный метод - приостановить митохондрии в кювете с регулируемой температурой с мешалкой или многолуночном планшете и определить изменение общей передачи или эмиссии инкубации в ответ на эффекторы мембранного потенциала. Катионы используются в диапазоне концентраций, достаточном для того, чтобы приводить к агрегации и гашению флуоресценции в матрице, и в результате общий сигнал от кюветы уменьшается в зависимости от накопления матрицы, и, следовательно, Δψм. Флуоресцентный ответ обычно калибруется параллельно, варьируя внешний [K +] в присутствии валиномицина и применяя уравнение Нернста, предполагая постоянный внутренний [K +] [50]. Между ПДС и потоками через три модуля окислительного фосфорилирования при физиологических значениях ПДС существует сильная взаимосвязь (рис. 2В), поэтому большие изменения дыхания связаны с довольно небольшими изменениями ПДС. Хотя PMF действительно сообщает о биоэнергетическом статусе, он менее чувствителен к изменениям функций и в целом менее полезен, чем измерения частоты дыхания. Однако комбинация PMF и частоты дыхания намного более эффективна и информативна, чем измерение любого из них по отдельности.

Модульный кинетический анализ

Количественное измерение как протонного тока, так и ПДС позволяет проводить модульный кинетический анализ, позволяя полностью и количественно описать любое изменение функции и его первичных и вторичных участков действия. Например, важную роль количественного Δψм Определение, в сочетании с дыханием, предназначено для обнаружения и измерения тонких изменений в утечке протонов и эффективности взаимодействия между митохондриальными препаратами. В эквивалентной электрической схеме (рис. 1) проводимость компонента определяется с помощью закона Ома как ток, приходящийся на единицу разности потенциалов. Аналогичный подход был использован для количественной оценки протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны. Δψм (или лучше, pmf) определяется параллельно с дыханием, обычно с кислородом и электродами TPMP +, вставленными в одну и ту же инкубацию. В отсутствие чистого синтеза АТФ это позволяет рассчитать базальную протонную проводимость мембраны [21,45], она неомическая и непропорционально увеличивается при высокой ПДС [19,51]. Поэтому для получения большей части информации об утечке протонов необходимо создать график ток / напряжение для проводимости в диапазоне потенциалов, начиная с состояния 4 и постепенно ограничивая перенос электронов, например, титрованием малоната в изолированную митохондриальную инкубационную окислительную среду. сукцината и одновременно определяя дыхание и ПДС [19,22] или Δψм с электродом TPMP в присутствии нигерицина [33,52] (кривая «протонной утечки» на рисунке 2B). Этот модульный кинетический анализ затем можно повторить для двух других модулей окислительного фосфорилирования (окисление субстрата и оборот АТФ), что дает полную картину функционального состояния митохондрий (рис. 2В).

Модульный кинетический анализ полностью описывает (на системном уровне) любое функциональное изменение окислительного фосфорилирования. Как только дисфункция обнаруживается путем измерения RCR и абсолютной частоты дыхания, модульный кинетический анализ является методом выбора для выявления первичных и вторичных причин этой дисфункции.

Концентрации и активность комплексов-кандидатов и ферментов

Очень распространенный подход к решению биоэнергетической дисфункции митохондрий - измерение экспрессии, концентрации или максимальной активности нескольких возможных комплексов переноса электронов или метаболических ферментов, таких как комплекс I, комплекс IV или ферменты цикла трикарбоновых кислот. Одной из причин популярности подхода-кандидата является легкость, с которой конкретные транскрипты могут быть проанализированы в микроматрицах, конкретные белки могут быть проанализированы с использованием технологии антител, а активность конкретных ферментов может быть проанализирована с использованием коммерческих наборов. Неявное предположение состоит в том, что эти белки контролируют частоту дыхания и биоэнергетическую функцию, поэтому, если они изменены, функция должна быть изменена, а если они не изменены, функция должна быть неизменной. Это неверно по двум причинам. Во-первых, контроль над скоростью оборота АТФ или окисления субстрата в изолированных митохондриях широко распространен, при этом ни один фермент не ограничивает скорость, а распределение контроля изменяется при изменении условий (например, рис. 2С). Возможно, кандидат имеет значительный контроль в выбранных условиях, и изменение его активности правильно сообщает о биоэнергетической дисфункции. Однако столь же вероятно, что умеренные изменения активности комплекса-кандидата мало влияют на общее поведение системы, приводя к ложным срабатываниям. Во-вторых, функция зависит от целостности многих процессов, поэтому даже шаги, которые не контролируются при нормальных условиях, могут стать сильно контролирующими скорость, если они будут скомпрометированы. Исключение этих шагов из списка кандидатов приведет к ложноотрицательным результатам.

Другие специфические функции и дисфункции

Выбор того, какую дисфункцию следует измерить, зависит от конкретного задаваемого вопроса. Специализированные функции митохондрий включают цикл мочевины, цикл γ-аминомасляной кислоты, метаболизм аминокислот, одноуглеродный метаболизм, синтез белка FeS, синтез гема, метаболизм жирных кислот, транспорт кальция и гомеостаз, метаболизм активных форм кислорода, переходную пору проницаемости митохондрий. в контроле цитохрома c высвобождение и апоптоз, и деление и слияние. Анализ дисфункций этих специфических путей потребует специализированных подходов, а не общих биоэнергетических подходов, изложенных в настоящей статье.

Резюме: определение дисфункции изолированных митохондрий.

Самый простой и наиболее показательный тест на энергетическую дисфункцию в изолированных митохондриях - это измерение митохондриального респираторного контроля. Абсолютные значения скорости дыхания в различных состояниях и условиях, а также качественные измерения ПДС могут прояснить механизмы, но лучший способ получить представление о механизме - это одновременно титровать как частоту дыхания, так и ПДС и построить кинетику различных модулей окислительного фосфорилирования ( Рисунок 2B). Возможные анализы количества или активности конкретных комплексов и ферментов, морфологии митохондрий и реакции на специфические стрессоры могут быть полезны для проверки конкретных гипотез, но, как правило, их следует держать в резерве и не использовать в качестве первичного анализа митохондриальной дисфункции.


Митохондриальная биология

- Средний заряд кластеров железа находится между Fe2 + и Fe3 +.

- Кластеры могут одновременно удерживать только один электрон.

- Энергетическая сила, исходящая от прошедшего электрона от НАДН, который был передан флавопротеинам и кластерам железо-сера, преобразуется в физическую силу, которая сдвигает структуру туннеля.

- Загруженный CoQ связывается с комплексом 3 стыковочного узла. 2 протона высвобождаются из CoQH2 во внутреннее пространство митохондриальной мембраны.

- Электрон с более низкой энергией (один из двух) проходит через кластер сульфированного железа к цитохрому C.

- Электрон с более высокой энергией транспортируется через цитохром B в комплексе 3, а затем принудительно направляется на CoQ, образуя CoQH. РАДИКАЛЬНАЯ ФОРМА COQ (CoQH).

- Поскольку радикальная форма очень нестабильна, она получает другой электрон, передаваемый от цитохрома B (от другого последнего CoQH2, поступающего в комплекс 3). Это выполняет радикал, снова делая его CoQH2. Он перемещается назад к сайту связывания комплекса 3, а затем высвобождает два протона, которые связаны с вновь образованным CoQH2.


Применение излучения

  • Лечение рака: радиация используется для уничтожения раковых клеток. Традиционная лучевая терапия использует высокоэнергетические рентгеновские лучи или гамма-лучи для нацеливания на рак. Из-за их большого диапазона это может привести к повреждению окружающих здоровых клеток. Чтобы свести к минимуму этот риск, лечение обычно назначается несколькими небольшими дозами. Протонная лучевая терапия - относительно новый вид лечения. Он использует протоны высокой энергии (от ускорителя частиц) для нацеливания на клетки. Скорость потери энергии для тяжелых ионов, таких как протоны, следует характерной кривой Брэгга, как показано ниже. Кривая показывает, что протоны будут отдавать энергию только на четко определенном расстоянии, и, следовательно, повреждение здоровых клеток уменьшается.

Типичная форма кривой Брэгга, показывающая изменение скорости потери энергии тяжелым ионом, например протоном, в зависимости от пройденного расстояния. Резкое падение (пик Брэгга) используется протонной лучевой терапией.


6. Конструкция экранирования

В этом разделе мы кратко рассмотрим конструкцию экранирования для защиты людей от паразитного излучения. В частности, мы сосредоточимся на объемных экранирующих барьерах (например, стенах, потолках) и лабиринтах. Объемное экранирование является чрезвычайно важным аспектом конструкции установки, поскольку оборудование для протонной терапии способно создавать смертельные уровни паразитного излучения. Кроме того, объемное экранирование ограничивает пространство, доступное для оборудования и персонала, и является дорогостоящим. Во многих отношениях конструкция объемного экранирования является классической инженерной проблемой, при которой разрабатывается решение, которое включает приемлемый баланс конкурирующих атрибутов безопасности, полезности и стоимости.

В общих чертах, чтобы спроектировать экранирование, необходимо иметь представление о производстве, переносе и ослаблении паразитного излучения в экранирующих барьерах. Кроме того, цели конструкции защиты, т. Е. Допустимая мощность облучения в занятом месте, зависят от доли времени, в течение которого зона занята, ее обозначения как контролируемой или неконтролируемой зоны и типа присутствующих лиц, т. Е. Пациентов, персонала ( радиационные работники) и широкая общественность. Обычно необходимо достичь нескольких целей дизайна, например: один для краткосрочного воздействия (в среднем за один час) и один для долгосрочного воздействия (в среднем за один год). В общем, никто не знает априори какая проектная цель в конечном итоге будет определять дизайн экранирования, что потребует расчетов экранирования, которые представляют несколько сценариев.

Прежде чем обсуждать основы физики конструкции экранирования, мы сделаем небольшое отступление и отметим, что экранирующие барьеры являются одним из нескольких необходимых компонентов эффективной программы радиационной защиты. Сами по себе экранирующие барьеры не обеспечивают безопасность. Непрактично, не говоря уже о непомерно дороговизне, создавать экраны, которые сами по себе обеспечивают адекватную защиту для неограниченного использования современных систем протонной терапии. Следовательно, необходим административный контроль использования луча, и по очевидным причинам ожидаемое использование луча должно быть принято во внимание в процессе проектирования экранирования. Знание об использовании протонного пучка часто трудно предсказать, особенно для первых в своем роде лечебных установок, где производство нейтронов в системах получения и доставки пучка малоизвестно. Кроме того, будущие результаты клинических испытаний или изменение политики здравоохранения могут резко изменить использование протонного пучка. Оставляя в стороне эти неопределенности, необходимо знать не только использование пучка (энергии, заряды и токи, а также направления движения) в каждом из мест обработки, но также все соответствующие скорости потери протонов в ускорителе, систему выбора энергии ( если имеется), систему транспортировки пучка и лечебную головку. Потери протонов и образование нейтронов сильно зависят от энергии протонного пучка и других факторов (см. Рисунок 22), что требует отдельных расчетов для нескольких энергий протонного пучка (Newhauser и другие 2002d). Многие аспекты защиты установок протонной терапии аналогичны таковым для установок фотонной терапии, которые были подробно рассмотрены в другом месте (NCRP 2008).

Рис 22. (Верхний) Уровень лечения в установке протонной терапии: циклотрон на 235 МэВ (1), графитовый дегрейдер переменной толщины (2), магниты для анализа импульса (3), щели (4), латунный коллиматор (5) и ограничитель луча в изоцентре. (6). На плане также показана главная диспетчерская (b), выход из лабиринта процедурной комнаты (m, n, o, a), а также различные коридоры и жилые помещения на уровне выше (c – k) (Newhauser и другие 2002c). (Нижний) Расчетные спектры эквивалентной дозы нейтронов в точках l – o в помещении портала и его лабиринте (см. Рисунок 1), создаваемые пучком протонов с энергией 235 МэВ. Ордината соответствует произведению коэффициента преобразования флюенса нейтронов в эквивалент дозы. часΦ, спектральный флюенс нейтронов ΦE, а энергия нейтрона Eп, где произведение нормировано на суммарный эквивалент дозы нейтронов ЧАС. Эти спектры показывают различия в форме из-за относительного вклада пиков тепловых нейтронов, нейтронов испарения и каскадных нейтронов. Область от 10 –6 до 10 –2 МэВ, соответствующая 1 /Eп поведение спектрального флюенса, вносит относительно небольшой вклад в общий эквивалент дозы (воспроизведено с разрешения Newhauser и другие 2002c).

Предполагая, что использование пучка, коэффициенты занятости и другие аспекты известны, можно рассчитать мощность эквивалента нейтронной дозы в интересующей точке за экранирующим барьером плиты (например, стена, потолок, и т.п.), которая параллельна и находится на расстоянии а пучок протонов согласно

куда ЧАС(Eп, θ, d / λ) - амбиентный эквивалент дозы за экраном, Eп - энергия протонного пучка, θ - угол вылета из точки потери протона и интересующей точки, р расстояние между точкой потери протона и интересующей точкой, d толщина щита, λ(θ) - длина затухания материала экрана, ЧАСо(Eп, θ) - исходный член, α - угол падения излучения, падающего на экран, а g (a) - соответствующий коэффициент наклона. Этот полуэмпирический подход, основанный на работе Мойера (1962), имеет много привлекательных атрибутов, включая включение основных зависимостей, простоту и скорость вычислений. Спустя пять десятилетий, несмотря на свои ограничения, модель Мойера по-прежнему широко используется, особенно в тех случаях, когда скорость и удобство важнее точности.

Персонал должен иметь возможность быстро входить в экранированные хранилища и выходить из них, например для эффективной повседневной клинической работы в чрезвычайных ситуациях, например, для оказания помощи больному пациенту, а также для обслуживания и ремонта ускорителя и системы транспортировки пучка. Это требует больших отверстий в объемных экранирующих стенах. Очевидно, что такие отверстия приводят к снижению затухания, которое необходимо восстановить. Обычно требуемое затухание восстанавливается путем оснащения отверстия длинным и изогнутым экранирующим туннелем, обычно называемым лабиринтом или лабиринтом. Лабиринт ослабляет падающее на него излучение двумя способами: его стенки ослабляют глубоко проникающее излучение, падающее на стенки лабиринта, и ослабляет менее проникающее излучение, попадающее в отверстие лабиринта, за счет комбинации рассеяния и поглощения. процессы, поскольку излучение распространяется через лабиринт.

Обычно лабиринты процедурных кабинетов не оборудованы массивными экранированными дверями, поскольку они могут значительно увеличить время доступа. С другой стороны, редко используемые хранилища (например, для ускорителя и системы транспортировки пучка) обычно используют лабиринт, оборудованный массивной защитной дверью.

Мощность эквивалентной дозы за пределами лабиринта (без двери) от рассеянного излучения, попадающего во вход в лабиринт (внутри хранилища), определяется выражением

куда р1 это расстояние прямой видимости от источника до интересующей точки в первой (ближайшей к источнику) части лабиринта, ЧАСо(а) - эквивалент дозы на расстоянии а из источника, а расстояние от источника до входа в первую ногу, и жя(ря) являются коэффициентами ослабления для последующих этапов лабиринта (Agosteo 2009). Они даны

куда ря это расстояние от входа в я-й отрезок до интересующей точки на этом отрезке, и где Ая площадь поперечного сечения я-я нога лабиринта (Agosteo 2009). Кроме того, необходимо (по отдельности) учитывать ослабление излучения, падающего на внешнюю сторону стен лабиринта (например, с использованием модели Мойера), и ослабление в дверях лабиринта в тех случаях, когда они используются. Затухание лабиринта увеличивается с увеличением количества и длины ног, толщины стенок лабиринта и уменьшается с увеличением площади поперечного сечения. Трудно переоценить высокую относительную важность дизайна лабиринтов. К счастью, существует несколько методов проектирования, которые хорошо изучены, точны и подтверждены измерениями в клинических установках протонной терапии.

Материалы, используемые для объемных экранирующих барьеров и лабиринтов, несколько различаются в зависимости от стоимости и доступности экранирующих материалов, а также стоимости пространства, занимаемого экранирующими барьерами. Обычно используется обычный бетон со стальной арматурой из-за его большого содержания водорода и массовой плотности (2,35 г / см3), высокой прочности, хорошей доступности и низкой стоимости. В современных центрах протонной терапии используются бетонные защитные барьеры толщиной до нескольких метров (Newhauser и другие 2002, Титт и Ньюхаузер 2005). Длина затухания нейтронов или толщина, необходимая для уменьшения падающего флюенса в 1 /е, показан на рисунке 23 для обычного бетона. На пределе высоких энергий длина затухания составляет примерно 50 см обычного бетона (Moritz, 2001).Плотность и амортизирующие свойства бетона можно существенно повысить за счет использования заполнителя с высокой плотностью, но его более высокая стоимость в большинстве случаев является недопустимой. На некоторых объектах использовались сравнительно небольшие «местные» щиты, например для экранирования компонентов линии пучка, которые производят большое количество нейтронов, чтобы уменьшить требования к затуханию для больших массивных экранов. В некоторых случаях материалы с более высокой плотностью, такие как сплавы железа (7,9 г / см3) или вольфрама (19,25 г / см3), могут быть полезными для защиты от нейтронов высокой энергии, поскольку их можно сделать более компактными, чем из бетона или других материалов. сыпучие защитные материалы. Стопоры протонного пучка, которые предотвращают попадание первичного протонного пучка на объемную защиту, изготовлены из различных материалов, включая пластик и сталь.

Рисунок 23. Длина затухания нейтронов в бетоне против энергия пучка протонов (воспроизведено с разрешения Agosteo и другие 2007).

Методы проектирования защиты, наиболее часто используемые для установок протонной терапии, - это аналитические формулы и моделирование методом Монте-Карло. Знания о неопределенностях в прогнозах обоих этих методов неполны. Newhauser и другие (2002c) измеряли, рассчитывали (с использованием полуэмпирических аналитических моделей, которые были разработаны для геометрии экранирования плит и лабиринтов) и моделировали мощности дозы нейтронов в центре протонной терапии 235 МэВ, и они обнаружили, что аналитическая модель завышает дозу нейтронов в большинстве положений. по сравнению с измерениями, тогда как моделирование методом Монте-Карло более соответствовало измерениям. Однако метод Монте-Карло значительно сложнее из-за необходимости получения сходимости обобщенных решений и отсутствия методов автоматического уменьшения дисперсии. Титт и Ньюхаузер (2005) оценили неопределенность, связанную с методом экранирования по методу Монте-Карло, сравнив аналитические прогнозы с подробным моделированием методом Монте-Карло эквивалентных доз нейтронов в различных местах расположения рецепторов. Они обнаружили, что оптимальным критерием отклонения для моделирования методом Монте-Карло является 10% -ная статистическая неопределенность. Этот критерий отклонения обеспечил дополнительную уверенность, поскольку практически все принятые результаты моделирования совпали.

В неопубликованном исследовании один из нас (WN) оценил стоимость бетона и стали, используемых для экранирования типичной многокомнатной протонной терапии, примерно в 6 миллионов долларов США, с потенциалом снижения затрат на экранирование почти на треть за счет улучшенных конструкций защиты от нейтронов. . Очевидно, существует значительный потенциал для достижения экономии затрат и других преимуществ за счет разработки улучшенных методов проектирования экранов и оптимизации конструкций экранов.

Хотя мы не обсуждали небольшие локальные экраны компонентов канала пучка в этом разделе, существует значительное совпадение с материалом, представленным в предыдущем разделе, для краткости мы не будем рассматривать здесь паразитное излучение внутри процедурной комнаты.


Роль разобщающего белка 3 в физиологии человека

Отделение эндокринологии, диабета и медицинской генетики и медицинский факультет Медицинского университета Южной Каролины и Медицинский центр по делам ветеранов Ральфа Х. Джонсона, Чарльстон, Южная Каролина, США

Адрес для корреспонденции: W. Timothy Garvey, Отдел эндокринологии, диабета и медицинской генетики, Здание клинической науки 816, Медицинский университет Южной Каролины, 96 Jonathan Lucas Street, Чарльстон, Южная Каролина 29425, США. Телефон: (843) 876-5372 Факс: (843) 876-5133 Электронная почта: [email protected]

Опубликовано 15 февраля 2003 г. - Подробнее

Ожирение понимается просто как дисбаланс между потреблением и расходом энергии в пользу увеличения веса. Однако биологическая связь человека между потреблением пищи и рассеянием энергии приводит к широким индивидуальным различиям в пищевом поведении, физической активности и эффективности хранения топлива и метаболизма. В частности, скорость основного метаболизма, на которую приходится наибольшая часть общих затрат энергии, может отличаться у разных людей почти в два раза. Традиционно считается, что три основных биохимических системы способствуют базальному термогенезу: бесполезные циклы, активность Na + / K + АТФазы и утечка митохондриальных протонов. Последний является наиболее важным количественным фактором и может объяснить до 50% основной скорости метаболизма (1). Молекулярная основа утечки митохондриальных протонов неясна, несмотря на ее важность для понимания энергетического баланса и его потенциала в качестве терапевтической мишени для лечения ожирения. Статья Хесселинка и его коллег в этом выпуске JCI (2) выясняет, вносит ли разобщающий белок 3 вклад в утечку митохондриальных протонов в скелетные мышцы человека.

Окисление жирных кислот и пирувата происходит в митохондриях, где энергия преобразуется в АТФ для использования в клеточных процессах. Восстановительные эквиваленты извлекаются из субстратов и последовательно передаются от доноров электронов (восстановителей) к акцепторам (окислителям) по дыхательной цепи митохондрий в молекулярный кислород. Электронно-транспортная система расположена на внутренней митохондриальной мембране, где стадии окисления связаны транспортной цепью с вытеснением протонов из матрицы. Это устанавливает электрохимическую разность потенциалов на внутренней мембране и движущую силу для входа протонов через F1F0-АТФ-синтаза. АТФ-синтаза улавливает потенциальную энергию, высвобождаемую при повторном входе протона, превращая АДФ в АТФ. Таким образом, перенос электронов связан с окислительным фосфорилированием. В идеально связанной системе протоны проникают в матрикс митохондрий только через АТФ-синтазу в присутствии АДФ, эта форма дыхания классифицируется как состояние 3 (т. Е. O2 расходуется только в присутствии субстрата и АДФ). Тем не менее, митохондрии также могут использовать кислород даже в отсутствие АДФ, что происходит, когда протоны просачиваются обратно в матрицу по механизму, который не включает F1F0-ATPase. Эта утечка протонов снижает протонный градиент, приводящий к образованию АТФ, и отделяет дыхание от окислительного фосфорилирования. Утилизация кислорода в отсутствие АДФ или в полностью несвязанных митохондриях называется дыханием в состоянии 4.

Механизмы, опосредующие независимую от АТФазу утечку протонов, не были идентифицированы, за исключением коричневой жировой ткани млекопитающих (BAT). BAT богаты митохондриями и липидными каплями и являются основным источником неподвижного термогенеза, используемого большинством млекопитающих для защиты от холода. Эта функция опосредуется разобщающим белком 1 (UCP1) (ранее известным как разобщающий белок или термогенин), впервые клонированным в 1985 г. (3). UCP1 локализуется на внутренней мембране митохондрий и рассеивает трансмембранный потенциал, транспортируя протоны из межмембранного пространства обратно в матрицу. Это снижает движущую силу протона, которая стимулирует образование АТФ, и дыхание в несвязанных митохондриях продолжается, высвобождая энергию топлива только в виде тепла. У людей и других крупных млекопитающих BAT исчезает после младенчества, а у взрослых экспрессия UCP1 минимальна или отсутствует. Однако даже в отсутствие UCP1 существует конечная утечка протонов через внутреннюю мембрану, которую нельзя объяснить простой диффузией (4). Это побудило исследователей искать дополнительные расцепляющие белки с более широкой тканевой экспрессией, и в 1997 году были идентифицированы два других члена семейства расцепляющих белков. Гены, кодирующие UCP2 (5, 6) и UCP3 (7, 8) человека, расположены в непосредственной близости от друг друга на хромосоме 11q13 и имеют 55% и 57% аминокислотную идентичность с UCP1, соответственно. МРНК UCP2 широко экспрессируется во многих тканях, тогда как UCP3 демонстрирует более ограниченную тканеспецифическую экспрессию, ограниченную скелетными мышцами и коричневой жировой тканью. UCPs имеют сходную предсказанную топологию, состоящую из шести трансмембранных областей, связанных полярными петлями и локализованных на внутренней митохондриальной мембране. Совсем недавно были идентифицированы два дополнительных UCP-подобных гена, UCP4 и UCP5 / мозговой митохондриальный белок-носитель-1, которые экспрессируются в головном мозге и имеют относительно более низкую аминокислотную идентичность с UCP1 (30-40%).

Из-за их гомологии с UCP1 и экспрессии во взрослых тканях, UCP2 и UCP3 сразу же стали рассматриваться как привлекательные кандидаты на роль белков, участвующих в расходе энергии. Было показано, что при экспрессии в клеточных линиях дрожжей и млекопитающих как UCP2, так и UCP3, как и UCP1, действуют как разобщители, о чем свидетельствует снижение потенциала митохондриальной мембраны и увеличение митохондриального состояния 4 дыхания, цельная клетка O2 потребление и производство тепла. Кроме того, UCP1, UCP2 и UPC3 имеют общую способность регулироваться факторами, важными для энергетического баланса, включая агонисты β3-адренорецепторов, трийодтиронин, прием пищи и воздействие холода (хотя холод оказывает более умеренное влияние на UCP2 и UCP3, чем на UCP3). UCP1). Однако парадигма начала распадаться, когда были рассмотрены результаты экспериментов на всем животном. Во-первых, было обнаружено, что как голодание, так и кормление с высоким содержанием жиров у грызунов активизируют UCP2 и UCP3, хотя первое вызывало снижение расхода энергии, а второе оказывало противоположный эффект (3). Во-вторых, мыши с нокаутом по UCP2 и UCP3 демонстрировали нормальную массу тела при потреблении обычной или жирной пищи, а также нормальную температуру тела при комнатной температуре и в ответ на холод (9, 10). Парадоксально, но митохондрии, выделенные из скелетных мышц мышей с нулевым UCP3, показали сниженную утечку протонов, увеличение соотношения АТФ / АДФ и снижение дыхания в состоянии 4, что согласуется с эффектом разобщения для UCP3, когда он присутствует в дикой природе. -типа мышей. Трансгенные мыши с гиперэкспрессией UCP3 характеризовались пониженной массой тела, несмотря на гиперфагию, за счет увеличения O в состоянии покоя.2 потребление и повышение температуры мышц, но не температуры тела. В то же время изолированные митохондрии демонстрируют пониженный трансмембранный потенциал и усиление дыхания в состоянии 4. Эти результаты у трансгенных мышей больше соответствовали роли UCP3 как митохондриального разобщителя.

Hesselink et al. (2) изучали способность UCP3 действовать как разобщитель в скелетных мышцах человека после индуцированного диетой увеличения экспрессии UCP3. Здоровые добровольцы-мужчины экспрессировали на 44% больше белка UCP3 в скелетных мышцах при соблюдении диеты с высоким содержанием жиров, чем при потреблении диеты с низким содержанием жиров. Исследователи оценили функцию митохондрий in vivo, измерив ресинтез фосфокреатина после аноксических сокращений мышц. Чтобы обеспечить быстрое сокращение мышц, высокоэнергетические фосфатные связи сохраняются в виде фосфокреатина, который образуется в результате передачи фосфата от АТФ к креатину, катализируемой креатинкиназой. Скорость ресинтеза фосфокреатина отражает скорость синтеза АТФ через митохондриальный F1F0-АТФаза, на которую, в свою очередь, влияет степень митохондриального разобщения. Авторы наблюдали аналогичные временные ходы восполнения запасов фосфокреатина в подгруппах с высоким и низким содержанием жиров, что указывает на то, что физиологическая активация UCP3 при питании с высоким содержанием жиров не влияет на утечку митохондриальных протонов in vivo. Авторы также обнаружили, что относительные количества свободного карнитина и ацилкарнитина были одинаковыми в обеих подгруппах, подтверждая отсутствие различий в доступности субстрата (по крайней мере, от длинноцепочечных жирных кислот). Авторы смогли отвергнуть свою первоначальную гипотезу и заключить, что UCP 3 не действует как митохондриальный разобщитель в мышцах человека в этих физиологических условиях.

Статья поучительна по нескольким причинам. Во-первых, авторы количественно определили экспрессию UCP3 на уровне белка, используя хорошо охарактеризованные и специфически очищенные с помощью аффинности антитела. На сегодняшний день литература в значительной степени полагается на измерения мРНК для изучения экспрессии UCP2 и UCP3, поскольку доступные антитела не обладают специфичностью. Во-вторых, авторы оценили митохондриальное разобщение in vivo после индуцированного диетой физиологического нарушения уровней UCP3. У мышей с нокаутом доказательства того, что UCP2 или UCP3 функционируют как разобщитель, были получены в экспериментах, проведенных в изолированных митохондриях ex vivo, а не в интактных тканях. Отсутствие влияния на энергетический метаболизм и массу тела у этих мышей предполагает, что разобщение в изолированных митохондриях либо не происходит in vivo, либо не является физиологически значимым. Кроме того, Бранд и его коллеги недавно обнаружили, что разобщение в присутствии супрафизиологической гиперэкспрессии UCP3 на высоких уровнях, полученных в трансфицированных дрожжах и у трансгенных мышей UCP3, вызвано артефактом и не отражает свойства нативного белка (11). . Это наблюдение затрудняет получение значимой физиологической информации из исследования трансгенных мышей (12), у которых гиперэкспрессия UCP3 более чем в 50 раз превышает уровень у мышей дикого типа (11). Возникающая картина заключается в том, что точную физиологическую информацию можно наиболее уверенно получить, когда разобщение митохондрий оценивается in vivo в физиологическом диапазоне регуляции UCP.

В-третьих, авторы изучали людей. В то время как эксперименты с трансгенными мышами высоко ценились ведущими биомедицинскими журналами, эксперименты, связанные с физиологией человека, на мой взгляд, были относительно недооценены. В частности, в области расхода энергии проблематично экстраполировать данные по трансгенным мышам на физиологию человека, поскольку взрослые люди не имеют бурого жира, а выработка тепла на килограмм массы тела у людей намного ниже, чем у грызунов. Этот урок был усвоен в случае лептина, который оказывает основное влияние на температуру тела у грызунов, в то время как это физиологическое действие заметно ослаблено или отсутствует у людей (13, 14). Наблюдения Hesselink et al. (2) не только имеют прямое отношение к физиологии человека, но представляют собой одни из самых надежных данных в любой системе, относящейся к основной биохимической роли UCP3 как разобщителя. В целом, статья, кажется, доказывает старую пословицу о том, что, если вы хотите понять физиологию человека, иногда вам просто нужно изучать людей.

Есть также ограничения на интерпретацию данных. Авторы не могут исключить возможность того, что диетические нарушения вызвали какой-то другой фактор, который модулирует эффект разобщения UCP3, или что эффект разобщения был слишком слабым, чтобы его можно было различить с помощью этой методологии, несмотря на данные авторов о том, что скорость восполнения фосфокреатина чувствительна к митохондриальному субстрату. доступность. Авт. Также отмечают, что повышающая регуляция UCP3 могла быть уравновешена понижающей регуляцией UCP2 (или той из других неидентифицированных разобщителей), приводящей к отсутствию чистых изменений в утечке митохондриальных протонов. Авторы не учитывают эту возможность по двум причинам, по которым уровни мРНК UCP2 не изменились, и другие авторы предоставили иммунологические доказательства того, что белок UCP2 не экспрессируется в мышцах, несмотря на присутствие мРНК UCP2 (15). Тем не менее, эти последние наблюдения были зарегистрированы в мышцах грызунов, оставляя открытой возможность того, что белок UCP2 присутствует в мышцах человека.

Если выводы авторов верны, то какова биохимическая роль UCP3 у человека? Этот вопрос остается интригующим и важным для будущих исследований. Некоторые исследователи поддерживают идею о том, что UCP2 и UCP3 играют роль в снижении образования активных форм кислорода и, таким образом, защищают клетки от их повреждающего воздействия (16). Активные формы кислорода продуцируются в процессе митохондриального дыхания способом, который пропорционален трансмембранному потенциалу, поэтому эта роль требует, чтобы UCP3 функционировал как разобщитель. Другая интересная гипотеза заключается в том, что UCP3 может способствовать окислению липидов, действуя как переносчик анионов FFA. Повышенные уровни циркулирующих FFA связаны с повышенной экспрессией UCP3 в мышцах при различных физиологических состояниях (голодание, питание с высоким содержанием жиров, инфузия липидов, диабет, ожирение) независимо от каких-либо изменений в расходе энергии (3, 17, 18). Кроме того, мы описали донорно-акцепторный полиморфизм сплайсинга экзона 6 в UCP3, который связан с заметным снижением скорости базального окисления липидов и увеличением респираторного коэффициента покоя у афроамериканцев, говорящих на языке гулла (19). Трудно объяснить, как переносчик анионов FFA может способствовать окислению FFA, поскольку проникновение длинноцепочечных FFA через карнитинпальмитоилтрансферазу I и последующее окисление требует этерификации до CoA. Однако в условиях высокого потока ацил-КоА и окисления липидов накопление ацил-КоА будет пагубным для функции митохондрий, поскольку эти молекулы являются сильными поверхностно-активными веществами, которые могут повреждать мембраны, а чрезмерное связывание КоА в форме длинноцепочечных сложных эфиров FFA может ингибировать β-окисление и активность цикла трикарбоновых кислот. Известно, что UCP способны экспортировать анион FFA из митохондриального матрикса (20), но это могло бы помочь облегчить накопление ацил-CoA, только если бы была доступна тиоэстераза для удаления CoA из FFA. Недавно Moore et al. показали, что митохондриальная тиоэстераза-1 активируется у мышей с гиперэкспрессией UCP3, и предположили, что этот фермент может выполнять именно эту функцию в условиях повышенного потока ацил-КоА (21). Таким образом, можно предположить, что UCP3 может способствовать поддержанию повышенной скорости окисления липидов за счет экспорта аниона FFA. В любом случае, поскольку поиск истинной физиологической роли UCP3 продолжается, для уверенных выводов относительно физиологии человека потребуются исследования на людях.

См. Статью по теме, начинающуюся на странице 479.

Конфликт интересов: Автор заявил об отсутствии конфликта интересов.

Использованы нестандартные сокращения: коричневая жировая ткань (BAT), разобщающая белок 1 (UCP1).


Использованная литература

Ricquier D, Bouillaud F: гомологи разобщающих белков: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP и AtUCP. Biochem J. 2000, 345: 161-179. 10.1042 / 0264-6021: 3450161. Всесторонний обзор UCP.

Соланес Дж., Виал-Пуиг А., Гружик Д., Флиер Дж. С., Лоуэлл Б. Б.: ген человеческого разобщающего белка-3. J Biol Chem. 1997, 272: 25433-25436. 10.1074 / jbc.272.41.25433. Описание структуры гена UCP3.

Walker JE, Runswick MJ: Суперсемейство митохондриальных транспортных белков. J Bioenerg Biomembr. 1993, 25: 435-446. Обзор, включающий описание характерных особенностей суперсемейства белков, образованных митохондриальными переносчиками метаболитов.

ПРОСТО. База данных семейств и доменов белков, [http://ca.expasy.org/prosite/]

Saier MH: Векторный метаболизм и эволюция транспортных систем. J Bacteriol. 2000, 182: 5029-5035. 10.1128 / JB.182.18.5029-5035.2000. Обзор, в котором представлена ​​гипотеза о том, что все транспортные системы произошли от общего предка.

Jarmuszkiewicz W, Sluse-Goffart CM, Hryniewiecka L, Sluse FE: Идентификация и характеристика простейшего несцепляющегося белка в Acanthamoeba castellani. J Biol Chem. 1999, 274: 23198-23202. 10.1074 / jbc.274.33.23198.Биоэнергетические свойства митохондрий, выделенных из этой амебы, предполагают наличие разобщающего белка, подобного UCPs млекопитающих.

Miroux B, Frossard V, Raimbault S, Ricquier D, Bouillaud F: Топология митохондриального разобщающего белка коричневой жировой ткани, определенная с помощью антител против его антигенных сайтов, выявленных библиотекой слитых белков. EMBO J. 1993, 12: 3739-3745. Демонстрация шести трансмембранных областей в UCP1.

Трезеге В., Ле Со А., Дэвид С., Гурде С., Фиоре С., Диану А.С., Брандолин Г., Лаукен Г.: ковалентный тандемный димер митохондриального носителя АДФ / АТФ является функциональным. in vivo. Biochim Biophys Acta. 2000, 1457: 81-93. 10.1016 / S0005-2728 (99) 00115-2. Носители действуют как гомодимеры, и когда два мономера экспрессируются в тандеме, носитель является полностью функциональным.

Schleiff E, McBride H: Центральная матричная петля стимулирует импорт разобщающего белка 1 в митохондрии. J Cell Sci. 2000, 113: 2267-2272. Демонстрация механизма нацеливания и вставки UCP1 в митохондрии. разобщающие белки, или некоторые из них

Arechaga I, Ledesma A, Rial E: митохондриальный разобщающий белок UCP1: закрытая пора. IUBMB Life. 2001, 52: 165-173. 10.1080 / 15216540152845966. Обзор транспортных свойств UCP1 и предположение о существовании в ядре UCP1 поры транслокации.

Николлс Д.Г., Фергюсон С.Дж.: Биоэнергетика 3. 2002, Лондон: Academic Press, стандартный и современный учебник с всесторонним введением в мембранную биоэнергетику и хемиосмотическую теорию.

Николлс Д.Г., Локк Р.М.: Термогенные механизмы бурого жира. Physiol Rev.1984, 64: 1-64. Классический обзор термогенеза в коричневой жировой ткани и его регуляции.

Cassard-Doulcier AM, Gelly C, Fox N, Schrementi J, Raimbault S, Klaus S, Forest C, Bouillaud F, Ricquier D: Тканеспецифическая и β-адренергическая регуляция гена митохондриального белка разобщения: контроль с помощью СНГ-действующие элементы в 5'-фланкирующей области. Мол Эндокринол. 1993, 7: 497-506. Подробное описание структуры гена UCP1.

Ямада М., Хашида Т., Сибусава Н., Ивасаки Т., Мураками М., Монден Т., Сато Т., Мори М.: Геномная организация и функция промотора гена разобщающего белка 2 мыши (UCP2). FEBS Lett. 1998, 432: 65-69. 10.1016 / S0014-5793 (98) 00835-7. Строение гена UCP2.

Pecqueur C, Alves-Guerra MC, Gelly C, Levi-Meyrueis C, Couplan E, Collins S, Ricquier D, Bouillaud F, Miroux B: разобщающий белок 2, in vivo распределение, индукция при окислительном стрессе и доказательства регуляции трансляции. J Biol Chem. 2001, 276: 8705-8712. 10.1074 / jbc.M006938200. Трансляционная регуляция UCP2 и тканевое распределение.

Ацин А., Родригес М., Рике Х, Канет Е., Бутин Дж. А., Галицци Дж. П.: Клонирование и характеристика 5'-фланкирующей области гена разобщающего белка 3 человека (UCP3). Biochem Biophys Res Commun. 1999, 258: 278-283. 10.1006 / bbrc.1999.0530. Характеристика промоторной области в UCP3.

Echtay KS, Winkler E, Klingenberg M: Коэнзим Q является обязательным кофактором для разобщающей функции белка. Природа. 2000, 408: 609-613. 10.1038 / 35046114. Описание роли убихинона как кофактора UCP1.

Риал Э., Гонсалес-Баррозо М.М.: Физиологическая регуляция транспортной активности в разобщающих белках UCP1 и UCP2. Biochim Biophys Acta. 2001, 1504: 70-81. 10.1016 / S0005-2728 (00) 00240-1. Обзор регулирования UCP1 с исторической точки зрения.

Клингенберг М., Эхтай К.С.: Разъединение белков: проблемы с точки зрения биохимика. Biochim Biophys Acta. 2001, 1504: 128-143. 10.1016 / S0005-2728 (00) 00242-5. Обзор механизма транспорта и регуляции UCPs млекопитающих.

Гарлид К.Д., Ябурек М., Джезек П.: Механизм действия разобщающего белка. Biochem Soc Trans. 2001, 29: 803-806. 10.1042 / 0300-5127: 0290803. Обзор, обобщающий механизм транспорта UCP1 как носителя анионов жирных кислот.

Jezek P: Возможные физиологические роли митохондриальных разобщающих белков-UCPn. Int J Biochem Cell Biol. 2002, 34: 1190-1206. 10.1016 / S1357-2725 (02) 00061-4. Обзор гипотез о роли разобщающих белков млекопитающих.

Николлс Д.Г.: Митохондрии коричневой жировой ткани. Biochim Biophys Acta. 1979, 549: 1-29. 10.1016 / 0304-4173 (79) 90016-8. Обзор биоэнергетических свойств митохондрий бурого жира и разобщающего белка UCP1.

Флери С., Неверова М., Коллинз С., Реймбо С., Шампиньи О, Леви-Мейрюэ С., Буйо Ф., Селдин М.Ф., Сурвит Р.С., Рикье Д., Уорден С.Х.: Разобщающий белок-2: новый ген, связанный с ожирением и гиперинсулинемией. Нат Жене. 1997, 15: 269-272. Первое описание существования UCP2.

Arsenijevic D, Onuma H, Pecqueur C, Raimbault S, Manning BS, Miroux B, Couplan E, Alves-Guerra MC, Goubern M, Surwit R и др .: Нарушение гена разобщающего белка-2 у мышей показывает роль в иммунитете и производство активных форм кислорода. Нат Жене. 2000, 26: 435-439. 10.1038 / 82565. Мыши с нокаутом UCP2 - / - более устойчивы к инфекции и имеют более высокую продукцию ROS.

Zhang CY, Baffy G, Perret P, Krauss S, Peroni O, Grujic D, Hagen T, Vidal Puig J, Boss O, Kim YB и др.: Несвязанный белок-2 отрицательно регулирует секрецию инсулина и является основным звеном между ожирением, дисфункция бета-клеток и диабет 2 типа. Клетка. 2001, 105: 745-755. 10.1016 / S0092-8674 (01) 00378-6. У мышей с нокаутом UCP2 - / - наблюдаются более высокие уровни АТФ в островках поджелудочной железы и повышенная секреция инсулина.

Krauss S, Zhang CY, Lowell BB: Значительная часть протекания митохондриальных протонов в интактных тимоцитах зависит от экспрессии UCP2. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99: 118-122. 10.1073 / pnas.012410699. Сравнение биоэнергетических свойств тимоцитов с UCP2 и без него согласуется с разобщающей активностью белка.

Diehl AM, Hoek JB: Митохондриальное разобщение: роль разобщающих белков-носителей анионов и связь с термогенезом и контролем веса »Преимущества потери контроля ". J Bioenerg Biomembr. 1999, 31: 493-506. 10.1023 / A: 1005452624640. Обзор физиологической функции UCP1, UCP2 и UCP3.

Echtay KS, Roussel D, St-Pierre J, Jekabsons MB, Cadenas S, Stuart JA, Harper JA, Roebuck SJ, Morrison A, Pickering S, Clapham JC, Brand MD: Супероксид активирует митохондриальные разобщающие белки. Природа. 2002, 415: 96-99. 10.1038 / 415096a. Отчет, показывающий, что UCP2 действует как переносчик супероксидных ионов.

Samec S, Seydoux J, Dulloo AG: Роль гомологов UCP в скелетных мышцах и коричневой жировой ткани: медиаторы термогенеза или регуляторы липидов в качестве топливного субстрата. FASEB J. 1998, 12: 715-724. Парадоксальное наблюдение, что голодание приводит к увеличению уровней UCP2 и UCP3.

Ван М.Ю., Ли Й., Унгер Р.Х.: Новая форма липолиза, индуцированного лептином. J Biol Chem. 1999, 274: 17541-17544. 10.1074 / jbc.274.25.17541. Лептин вызывает липолиз в белой жировой ткани, но жирные кислоты окисляются в адипоцитах, а не экспортируются.

Босс О., Самек А., Паолони-Джакобино А., Россье С., Дулло А., Сейду Дж., Маззин П., Джакобино Дж. П.: Разобщающий белок-3: новый член семейства митохондриальных носителей с тканеспецифической экспрессией. FEBS Lett. 1997, 408: 39-42. 10.1016 / S0014-5793 (97) 00384-0. Первое описание существования UCP3.

Gong DW, Monemdjou S, Gavrilova O, Leon LR, Marcus-Samuels B, Chou CJ, Everett C, Kozak LP, Li C, Deng C и др.: Отсутствие ожирения и нормальная реакция на голодание и гормон щитовидной железы у мышей, лишенных сцепления белок-3. J Biol Chem. 2000, 275: 16251-16257. 10.1074 / jbc.M910177199. У мышей с нокаутом UCP3 не наблюдается изменений в метаболизме всего тела.

Клайн Г.В., Видал Пуч А.Дж., Дюфур С., Кадман К.С., Лоуэлл Б.Б., Шульман Г.И.: В естественных условиях эффекты разрушения гена разобщающего протеина-3 на энергетический метаболизм митохондрий. J Biol Chem. 2001, 276: 20240-20244. 10.1074 / jbc.M102540200. Демонстрация того, что митохондрии мышц мышей с нокаутом UCP3 обладают более высокой энергетической эффективностью и, следовательно, что in vivo UCP3 имеет разъединяющее действие.

Weigle DS, Selfridge LE, Schwartz MW, Seeley RJ, Cummings DE, Havel PJ, Kuijper JL, Beltran del Rio H: Повышенные жирные кислоты вызывают разобщающую экспрессию белка 3 в мышцах: возможное объяснение эффекта голодания. Диабет. 1998, 47: 298-302. Экспрессия UCP3 связана с использованием жирных кислот в качестве топлива, а не с необходимостью рассеивать энергию.

Химмс-Хаген Дж., Харпер М.Э .: Физиологическая роль UCP3 может заключаться в экспорте жирных кислот из митохондрий, когда преобладает окисление жирных кислот: гипотеза. Exp Biol Med. 2001, 226: 78-84. Обзор физиологической функции UCP3, представляющий гипотезу о том, что его роль заключается в экспорте жирных кислот из митохондриального матрикса.

Босс О, Хаген Т., Лоуэлл BB: Разобщающие белки 2 и 3: потенциальные регуляторы митохондриального энергетического метаболизма. Диабет. 2000, 49: 143-156. Обзор физиологической функции UCP2 и UCP3.

Curtin NA, Clapham JC, Barclay CJ: Избыточное восстановление тепла изолированными мышцами мышей, сверхэкспрессирующих разобщающий белок-3. J Physiol. 2002, 542: 231-235. 10.1113 / jphysiol.2002.021964. Демонстрация того, что мышечные клетки трансгенных мышей со сверхэкспрессией UCP3 имеют более низкую энергетическую эффективность.

Harper ME, Dent R, Monemdjou S, Bézaire V, Van Wyck L, Wells G, Kavaslar GN, Gauthier A, Tesson F, McPherson R: Уменьшение утечки митохондриальных протонов и снижение экспрессии разобщающего белка 3 в скелетных мышцах людей с ожирением, устойчивых к диете женщины. Диабет. 2002, 51: 2459-2466. Отчет, указывающий на роль UCP3 в рассеивании энергии у людей.

Консидин М.Дж., Дейли Д.О., Уилан Дж .: Экспрессия альтернативной оксидазы и несвязанного белка во время созревания плодов в манго. Plant Physiol. 2001, 126: 1619-1629. 10.1104 / pp.126.4.1619. UCP в манго играет важную роль в процессе созревания плодов.

SWISS-PROT / TrEMBL. SWISS-PROT - это тщательно подобранная база данных последовательностей белков, а TrEMBL - компьютерное приложение к SWISS-PROT. [Http://ca.expasy.org/sprot/]

GenBank. База данных последовательностей белков и ДНК., [Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank]