Информация

6.2: Выделение, культивирование и идентификация вирусов - биология

6.2: Выделение, культивирование и идентификация вирусов - биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Цели обучения

  • Обсудите, почему вирусы изначально считались фильтруемыми агентами.
  • Опишите выращивание вирусов, сбор образцов и обращение с ними.
  • Сравните методы in vivo и in vitro, используемые для культивирования вирусов.

В начале этой главы мы описали, как фарфоровые фильтры Чемберленда с порами, достаточно маленькими, чтобы пропускать вирусы, использовались для обнаружения TMV. Сегодня фарфоровые фильтры были заменены мембранными фильтрами и другими устройствами, используемыми для изоляции и идентификации вирусов.

Изоляция вирусов

В отличие от бактерий, многие из которых можно выращивать на искусственной питательной среде, вирусам для репликации требуется живая клетка-хозяин. Зараженные клетки-хозяева (эукариотические или прокариотические) можно культивировать и выращивать, а затем среду для роста можно собирать как источник вируса. Вирионы в жидкой среде можно отделить от клеток-хозяев центрифугированием или фильтрацией. Фильтры могут физически удалить из раствора все, что больше, чем вирионы; затем вирусы могут быть собраны в фильтрате (Рисунок ( PageIndex {1} )).

Упражнение ( PageIndex {1} )

Фильтр какого размера нужен для сбора вируса?

Выращивание вирусов

Вирусы можно выращивать in vivo (в целом живом организме, растении или животном) или in vitro (вне живого организма в клетках в искусственной среде, такой как пробирка, колба для культивирования клеток или пластина с агаром). Бактериофаги можно выращивать в присутствии плотного слоя бактерий (также называемого бактериальной лужайкой), выращенного на 0,7% мягком агаре в чашке Петри или плоской (горизонтальной) колбе (рисунок ( PageIndex {2a} )). Концентрация агара снижена с 1,5%, обычно используемых при культивировании бактерий. Мягкий 0,7% агар позволяет бактериофагам легко диффундировать в среде. Для литических бактериофагов лизинг бактериальных хозяев может быть легко обнаружен при обнаружении чистой зоны, называемой бляшкой (рисунок ( PageIndex {1b} )). Поскольку фаг убивает бактерии, на мутном бактериальном газоне наблюдается множество бляшек.

Вирусы животных требуют наличия клеток в организме животного-хозяина или клеток культуры ткани, полученных от животного. Культивирование животных вирусов важно для 1) идентификации и диагностики патогенных вирусов в клинических образцах, 2) производства вакцин и 3) фундаментальных научных исследований. Источниками хозяина in vivo могут быть развивающийся эмбрион в яйце с зародышем птицы (например, курица, индейка) или целое животное. Например, большая часть вакцины против гриппа, производимой для ежегодных программ вакцинации против гриппа, выращивается в куриных яйцах.

Эмбрион или животное-хозяин служит инкубатором для репликации вируса (рис. ( PageIndex {3} )). Расположение внутри эмбриона или животного-хозяина важно. Многие вирусы обладают тканевым тропизмом, и поэтому для роста их необходимо занести в определенное место. Внутри эмбриона целевые участки включают амниотическую полость, хориоаллантоисную мембрану или желточный мешок. Вирусная инфекция может повредить тканевые мембраны, вызывая поражения, называемые оспой; нарушить эмбриональное развитие; или вызвать гибель эмбриона.

Для исследований in vitro можно использовать различные типы клеток для поддержки роста вирусов. Первичная клеточная культура свежеприготовлена ​​из органов или тканей животных. Клетки извлекаются из тканей механическим соскабливанием или измельчением для высвобождения клеток или ферментативным методом с использованием трипсина или коллагеназы для разрушения ткани и высвобождения отдельных клеток в суспензию. Из-за требований зависимости от закрепления первичным клеточным культурам требуется жидкая культуральная среда в чашке Петри или колбе для тканевых культур, чтобы клетки имели твердую поверхность, такую ​​как стекло или пластик, для прикрепления и роста. Первичные культуры обычно имеют ограниченную продолжительность жизни. Когда клетки в первичной культуре подвергаются митозу и образуется достаточная плотность клеток, клетки вступают в контакт с другими клетками. Когда происходит этот межклеточный контакт, митоз останавливается. Это называется контактным ингибированием, и оно предотвращает слишком высокую плотность клеток. Чтобы предотвратить контактное ингибирование, клетки из первичной клеточной культуры необходимо перенести в другой сосуд со свежей питательной средой. Это называется вторичной культурой клеток. Периодически плотность клеток необходимо снижать, сливая некоторые клетки и добавляя свежую среду, чтобы обеспечить пространство и питательные вещества для поддержания роста клеток. В отличие от первичных клеточных культур, непрерывные клеточные линии, обычно полученные из трансформированных клеток или опухолей, часто можно многократно субкультивировать или даже бесконечно выращивать (в этом случае они называются бессмертными). Непрерывные клеточные линии могут не проявлять зависимости от закрепления (они будут расти в суспензии) и, возможно, утратили свое контактное ингибирование. В результате непрерывные клеточные линии могут расти кучками или комками, напоминающими небольшие опухолевые образования (рис. ( PageIndex {4} )).

Примером бессмертной клеточной линии является клеточная линия HeLa, которая первоначально была культивирована из опухолевых клеток, полученных от Генриетты Лакс, пациентки, умершей от рака шейки матки в 1951 году. Клетки HeLa были первой непрерывной клеточной линией культивирования тканей и использовались для установить культуру тканей как важную технологию для исследований в области клеточной биологии, вирусологии и медицины. До открытия клеток HeLa ученые не могли создать культуры тканей с какой-либо надежностью или стабильностью. Спустя более шести десятилетий эта клеточная линия все еще жива и используется для медицинских исследований. См. «Линия бессмертных клеток Генриетты Лакс», чтобы узнать больше об этой важной линии клеток и о спорных способах ее получения.

Упражнение ( PageIndex {2} )

Какое свойство клеток делает необходимым периодическое разведение первичных культур клеток?

БЕССМЕРТНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ГЕНРИЕТТЫ БЕЗОПАСНЫХ

В январе 1951 года Генриетте Лакс, 30-летней афроамериканке из Балтимора, в больнице Джона Хопкинса диагностировали рак шейки матки. Теперь мы знаем, что ее рак был вызван вирусом папилломы человека (ВПЧ). Цитопатические эффекты вируса изменили характеристики ее клеток в процессе, называемом трансформацией, которая дает клеткам способность непрерывно делиться. Эта способность, конечно же, привела к раковой опухоли, которая в конечном итоге убила миссис Лакс в октябре в возрасте 31 года. Перед ее смертью образцы ее раковых клеток были взяты без ее ведома или разрешения. В конечном итоге образцы оказались во владении доктора Джорджа Гея, биомедицинского исследователя из Университета Джонса Хопкинса. Гей смог вырастить некоторые клетки из образца Лакса, создав то, что сегодня известно как бессмертная клеточная линия HeLa. Эти клетки обладают способностью жить и расти бесконечно долго и даже сегодня все еще широко используются во многих областях исследований.

По словам мужа Лакса, ни Генриетта, ни семья не давали больнице разрешения на сбор образцов ее тканей. В самом деле, семья не знала до 20 лет после смерти Лакс, что ее клетки все еще живы и активно используются в коммерческих и исследовательских целях. Тем не менее, клетки HeLa сыграли решающую роль в многочисленных открытиях, связанных с полиомиелитом, раком и СПИДом, а также другими заболеваниями. Ячейки также были коммерциализированы, хотя сами они никогда не были запатентованы. Несмотря на это, в поместье Генриетты Лакс никогда не использовались клетки, хотя в 2013 году семье Лакс был передан контроль над публикацией генетической последовательности ее клеток.

Этот случай поднимает несколько биоэтических вопросов, связанных с информированным согласием пациентов и их правом знать. На момент изъятия салфеток Лакса не существовало никаких законов или инструкций об информированном согласии. Означает ли это, что в то время к ней относились справедливо? Конечно, по сегодняшним меркам ответ будет отрицательным. Изъятие тканей или органов у умирающего пациента без согласия считается не только неэтичным, но и незаконным, независимо от того, может ли такой акт спасти жизни других пациентов. Этично ли, в таком случае, для ученых продолжать использовать ткани Лакса для исследований, даже если они были получены незаконным путем по сегодняшним стандартам?

Этичные или нет, ячейки Лакса сегодня широко используются для стольких приложений, что перечислить их все невозможно. Является ли это случаем, когда цель оправдывает средства? Будет ли Лакс рада узнать о ее вкладе в науку и о миллионах людей, которым она принесла пользу? Хотела бы она, чтобы ее семья получила компенсацию за коммерческие продукты, разработанные с использованием ее клеток? Или она будет чувствовать себя изнасилованной и эксплуатируемой исследователями, взявшими часть ее тела без ее согласия? Поскольку ее никогда не спрашивали, мы никогда не узнаем.

Обнаружение вируса

Независимо от метода культивирования, после того, как вирус был введен во весь организм-хозяин, эмбрион или клетку тканевой культуры, образец может быть приготовлен из инфицированного хозяина, эмбриона или клеточной линии для дальнейшего анализа в ярком поле, электронном , или флуоресцентный микроскоп. Цитопатические эффекты (ЦПЭ) - это отчетливые наблюдаемые клеточные аномалии, вызванные вирусной инфекцией. CPE могут включать потерю сцепления с поверхностью контейнера, изменение формы клетки с плоской на круглую, сжатие ядра, вакуолей в цитоплазме, слияние цитоплазматических мембран и образование многоядерных синцитий, телец включения в ядре или цитоплазме. и полный лизис клеток (см. рисунок ( PageIndex {6} )).

Дальнейшие патологические изменения включают вирусное нарушение генома хозяина и превращение нормальных клеток в трансформированные клетки, которые являются типами клеток, связанных с карциномами и саркомами. Тип или серьезность CPE зависит от типа вируса. На рисунке ( PageIndex {6} ) перечислены CPE для определенных вирусов.

Посмотрите это видео, чтобы узнать о влиянии вирусов на клетки.

Анализ гемагглютинации

Серологический анализ используется для определения наличия определенных типов вирусов в сыворотке крови пациента. Сыворотка - это жидкая фракция плазмы крови соломенного цвета, из которой удалены факторы свертывания. Сыворотка может использоваться в прямом анализе, называемом анализом гемагглютинации, для обнаружения определенных типов вирусов в образце пациента. Гемагглютинация - это агглютинация (слипание) эритроцитов (красных кровяных телец). Многие вирусы производят поверхностные белки или шипы, называемые гемагглютининами, которые могут связываться с рецепторами на мембранах эритроцитов и вызывать агглютинирование клеток. Гемагглютинацию можно наблюдать без использования микроскопа, но этот метод не всегда позволяет различить инфекционные и неинфекционные вирусные частицы, поскольку оба могут агглютинировать эритроциты.

Чтобы идентифицировать конкретный патогенный вирус с помощью гемагглютинации, мы должны использовать непрямой подход. Белки, называемые антителами, вырабатываемые иммунной системой пациента для борьбы с конкретным вирусом, могут использоваться для связывания с такими компонентами, как гемагглютинины, которые однозначно связаны с конкретными типами вирусов. Связывание антител с гемагглютининами, обнаруженными на вирусе, впоследствии предотвращает прямое взаимодействие эритроцитов с вирусом. Таким образом, когда к вирусам, покрытым антителами, добавляются эритроциты, агглютинации не происходит; агглютинация подавлена. Мы называем эти типы непрямых анализов анализами ингибирования гемагглютинации (HAI) вирус-специфических антител. HAI можно использовать для обнаружения наличия антител, специфичных ко многим типам вирусов, которые могут вызывать или вызвали инфекцию у пациента даже через несколько месяцев или лет после заражения (см. Рисунок ( PageIndex {7} )). Этот анализ более подробно описан в разделе «Анализы агглютинации».

Упражнение ( PageIndex {3} )

Каков результат положительного теста на ОВЗ?

Тест амплификации нуклеиновой кислоты

Тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) используются в молекулярной биологии для обнаружения уникальных последовательностей нуклеиновых кислот вирусов в образцах пациентов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод NAAT, используемый для обнаружения вирусной ДНК в образце ткани или биологической жидкости пациента. ПЦР - это метод, который амплифицирует (то есть синтезирует множество копий) интересующего вирусного сегмента ДНК. С помощью ПЦР короткие нуклеотидные последовательности, называемые праймерами, связываются со специфическими последовательностями вирусной ДНК, что позволяет идентифицировать вирус.

ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) - это метод NAAT, используемый для обнаружения РНК-вирусов. ОТ-ПЦР отличается от ПЦР тем, что фермент обратная транскриптаза (ОТ) используется для получения кДНК из небольшого количества вирусной РНК в образце. Затем кДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР. И ПЦР, и ОТ-ПЦР используются для обнаружения и подтверждения присутствия вирусной нуклеиновой кислоты в образцах от пациентов.

ПОЧЕМУ ВПЧ

Мишель, 21-летняя студентка медсестры, пришла в университетскую клинику, обеспокоенная тем, что она могла заразиться венерическим заболеванием (ЗППП). У ее сексуального партнера недавно появилось несколько шишек на пенисе. Он отложил посещение врача, но Мишель подозревает, что это остроконечные кондиломы, вызванные ВПЧ. Она особенно обеспокоена тем, что знает, что ВПЧ не только вызывает бородавки, но и является основной причиной рака шейки матки. Она и ее партнер всегда используют презервативы для контрацепции, но она не уверена, что эта мера предосторожности защитит ее от ВПЧ.

Врач Мишель не обнаруживает физических признаков кондилом или других ЗППП, но рекомендует Мишель сдать мазок Папаниколау вместе с тестом на ВПЧ. Мазок Папаниколау позволяет выявить аномальные клетки шейки матки и CPE, связанные с ВПЧ; тест на ВПЧ проверит наличие вируса. Если оба теста отрицательны, Мишель может быть более уверена, что она, скорее всего, не заразилась ВПЧ. Однако ее врач предполагает, что для Мишель было бы разумно сделать прививку от ВПЧ, чтобы защитить себя от возможного заражения в будущем.

Упражнение ( PageIndex {4} )

Почему врач Мишель заказывает два разных теста вместо того, чтобы полагаться на один или другой?

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на способности антител обнаруживать и прикрепляться к конкретным биомолекулам, называемым антигенами. Обнаруживающее антитело прикрепляется к антигену-мишени с высокой степенью специфичности в том, что может быть сложной смесью биомолекул. В этот тип анализа также включен бесцветный фермент, присоединенный к детектирующему антителу. Фермент действует как метка на детектирующем антителе и может взаимодействовать с бесцветным субстратом, что приводит к получению окрашенного конечного продукта. EIA часто полагаются на слои антител для захвата и реакции с антигенами, все из которых прикреплены к мембранному фильтру (см. Рисунок ( PageIndex {8} )). ИФА на вирусные антигены часто используются в качестве предварительных скрининговых тестов. Если результаты положительные, для дальнейшего подтверждения потребуются тесты с еще большей чувствительностью, такие как вестерн-блоттинг или NAAT. Более подробно ОВОС обсуждаются в ОВОС и ИФА.

Упражнение ( PageIndex {5} )

Что обычно указывает на положительный результат теста EIA?

ЧАСТЬ 3

Наряду с анализом RT / PCR была также собрана слюна Дэвида для культивирования вирусов. Как правило, для прижизненной диагностики недостаточно одного диагностического теста, поскольку результаты будут зависеть от чувствительности анализа, количества вирионов, присутствующих во время тестирования, и времени проведения анализа, поскольку высвобождение вирионов в слюну может изменяться. Оказалось, что при культивировании вируса из слюны результат оказался отрицательным. Это не удивительно для врача Дэвида, потому что один отрицательный результат не является абсолютным признаком отсутствия инфекции. Возможно, во время отбора пробы количество вирионов в слюне невелико. Нет ничего необычного в том, чтобы повторять тест через определенные промежутки времени, чтобы повысить вероятность обнаружения более высоких вирусных нагрузок.

Упражнение ( PageIndex {6} )

Следует ли врачу Дэвида изменить курс лечения на основании этих результатов анализов?

Резюме

  • Для выращивания вирусов необходимо присутствие какой-либо формы клетки-хозяина (всего организма, эмбриона или культуры клеток).
  • Вирусы можно выделить из образцов путем фильтрации.
  • Вирусный фильтрат - богатый источник высвобождаемых вирионов.
  • Бактериофаги обнаруживаются по наличию прозрачного бляшки на бактериальном газоне.
  • Вирусы животных и растений обнаруживаются цитопатические эффекты, молекулярные методы (ПЦР, ОТ-ПЦР), иммуноферментные анализы и серологические анализы (анализ гемагглютинации, анализ ингибирования гемагглютинации).

Автор

  • Нина Паркер (Университет Шенандоа), Марк Шнегурт (Государственный университет Уичито), Ань-Хуэ Тхи Ту (Юго-Западный государственный университет Джорджии), Филип Листер (Центральный муниципальный колледж Нью-Мексико) и Брайан М. Форстер (Университет Святого Иосифа) со многими участвующие авторы. Исходный контент через Openstax (CC BY 4.0; бесплатный доступ по адресу https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


Выделение, посев и идентификация вируса гриппа A

Вирусы гриппа A (IAV) вызывают эпидемии и пандемии, которые приводят к значительному финансовому бремени и человеческим жертвам. Чтобы справиться с ежегодными эпидемиями IAV и подготовиться к будущим пандемиям, срочно необходимо более глубокое понимание того, как IAV возникают, передаются, вызывают заболевания и приобретают пандемический потенциал. Фундаментальные методы, необходимые для получения таких знаний, - это изоляция и культивирование IAV из экспериментальных и контрольных образцов. Здесь мы представляем подробный протокол сбора и обработки образцов IAV, амплификации в куриных яйцах или клетках млекопитающих и идентификации образцов, содержащих неизвестные патогены. Этот протокол является надежным и позволяет создавать вирусные культуры, которые можно использовать для последующего анализа. После получения экспериментальных или контрольных образцов могут быть созданы вирусные культуры, а наличие IAV может быть проверено в течение 3-5 дней с помощью обратной транскрипции (RT) -PCR или анализа гемагглютинации. Увеличенные временные рамки могут потребоваться для менее опытного лабораторного персонала или когда будет обрабатываться большое количество проб.

Заявление о конфликте интересов

КОНКУРЕНЦИЯ ФИНАНСОВЫХ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Цифры

Рисунок 1. Изоляция, культура и идентификация IAV…

Рисунок 1. Блок-схема протокола изоляции, культуры и идентификации IAV.

Обозначены части и подкомпоненты протокола…

Рис. 2. Инокуляция эмбриональных яиц и аллантоис…

Рис. 2. Инокуляция эмбриональных яиц и сбор аллантоисной жидкости.

(A) Графический продольный разрез…

Рис. 3. Цитопатические эффекты (ЦПЭ), вызванные IAV у…

Рисунок 3. Цитопатические эффекты (ЦПЭ), индуцированные IAV в клетках MDCK.

Клетки MDCK были ложно инфицированы (MEM-BSA…

Рисунок 4. Анализ гемагглютинации (НА).

Рисунок 4. Анализ гемагглютинации (НА).

(A) Образцы, не обладающие агглютинирующей активностью (левая панель) или содержащие IAV…

РНК собирали из вирусных запасов CA04 (H1N1), K173 (H1N1),…

274 nt) обозначен полосой справа, размеры стандартов двухцепочечной ДНК указаны слева (Nt = нуклеотиды), а описания дорожек, указывающие на входную матричную вирусную РНК, представлены справа от панели геля. (B) Показаны графики Rn / Ct ОТ-ПЦР в реальном времени для каждой вирусной матрицы. (C) График отображает значение Ct для каждой из реакций, представленных на панели (B). Пунктирная красная линия указывает порог для идентификации положительного образца (значение Ct образца должно быть ниже этой линии, чтобы его можно было уверенно считать «положительным»).


Выделение, анализ и культивирование вирусов

Вирусы выделяют из инфицированных клеток-хозяев, содержащих зрелые вирионы. Клетки механически разрушаются, и содержимое клеток высвобождается в подходящем буферном растворе. Суспензию, содержащую вирионы и клеточные ингредиенты, затем подвергают центрифугированию несколько раз с разными скоростями для фракционирования вирионов от других компонентов клетки. Такая процедура называется дифференциальным центрифугированием.

Более совершенный метод - центрифугирование в градиенте плотности, которое обычно применяется для получения более очищенного образца вирусов. Перед тем, как подвергнуть образец вируса центрифугированию в градиенте плотности, его сначала очищают дифференциальным центрифугированием. Градиент плотности готовят в центрифужной пробирке. Например, градиент сахарозы содержит линейно возрастающую концентрацию сахарозы сверху вниз центрифужной пробирки.

Частично очищенный образец вируса выливают сверху и пробирку подвергают высокоскоростному центрифугированию в течение нескольких часов в ультрацентрифуге. Центробежная сила движет вирусные частицы ко дну, пока они не осядут с градиентом плотности сахарозы, равным плотности вирионов, образуя концентрированную зону или полосу.

Затем суспензию вирионов можно удалить с этой полосы с помощью пипетки. Бактериофаги, вызывающие литические инфекции, могут быть выделены более или менее аналогичным методом путем дифференциального центрифугирования лизата для удаления клеточного дебриса и нелизированных интактных клеток бактерий-хозяев.

Анализ вирусов:

Вирусный анализ означает определение количества вирусных частиц в единице объема образца. Для этого доступно несколько методов. Общее количество вирусных частиц в образце, включая как жизнеспособные, так и нежизнеспособные вирионы, можно подсчитать непосредственно с помощью электронной микроскопии.

Для этого известный объем очищенного образца вируса смешивают с известным объемом суспензии мельчайших шариков полистирольного латекса известной концентрации. Смесь каплями распыляют на несущую мембрану, сушат и затемняют.

Из соотношения количества шариков и количества вирусных частиц можно рассчитать количество вирионов в единице объема при исследовании препарата под электронным микроскопом. Например, если в препарате капля обнаруживает присутствие 200 вирусных частиц и 20 латексных шариков, концентрация вирионов / мл должна быть 200/20 умножена на количество шариков на мл в суспензии.

Если концентрация гранул в исходной суспензии составляет 5 х 10 10 на мл. Количество вирусов будет 200/20 x 5 x 10 10 / мл = 5 x 10 11 / мл. Концентрация вирусов в образце также называется его титром. Среди других методов определения вирусных титров в образце очень важен метод определения бляшек.

Он использует инфекционность вирусов и их способность уничтожать инфицированные клетки. Метод бляшек был сначала разработан для обнаружения и подсчета бактериофагов, а затем был распространен на изучение вирусов животных. Метод бляшек широко используется благодаря своей простоте, точности и воспроизводимости.

Для определения бактериофагов образец разводят во много раз (

От 10-20 до 10-25) и смешивают с каплей плотной жидкой культуры бактерии-хозяина и несколькими миллилитрами расплавленной мягкой агаризованной среды при 44 ° C. Смесь выливают на поверхность уже затвердевшего твердого питательного агара в чашке и равномерно распределяют, чтобы фаги и бактерии распределились равномерно.

Ночная инкубация чашек показывает наличие ряда чистых участков, известных как бляшки, на лужайке, где постоянно растет бактерия-хозяин. Бляшки образуются из-за инфекции и разрушения клеток-хозяев, производящих чистые участки. Количество бляшек пропорционально концентрации вируса.

Каждая бляшка производится блоком формирования бляшек (PFU). Таким образом, если аликвота 0,1 мл образца фага в разведении 10-20 наносится на чашку и дает в среднем 40 бляшек на чашку, титр составляет 40 / 0,1 x 10 20 БОЕ / мл. Следует отметить, что количество PFU нельзя принимать равным количеству фагов, но они пропорциональны друг другу.

Метод бляшек с необходимой модификацией также использовался для анализа вирусов животных. Вместо бактерий в качестве хозяина используется суспензия культивируемых клеток животных. Бактериологическая питательная среда заменяется соответствующей питательной средой для культуры клеток животных.

Как и в случае анализа бактериофага, вирусный образец серийно разводят и аликвоты соответствующих разведений распределяют на монослоях клеток культуры-хозяина, растущих на твердой подложке, например. в чепухе. Вирионам дают прикрепиться к клеткам-хозяевам в течение часа или около того, а затем монослой покрывают мягким агаром или какой-либо другой гелеобразующей средой для предотвращения свободной горизонтальной диффузии вирусных частиц.

Частицы инфекционного потомства, высвобождаемые в результате лизиса инфицированных клеток, остаются более или менее локализованными с образованием очагов или бляшек. Бляшки можно подсчитать для определения титра инфекционности образца вируса. Для развития видимых бляшек может потребоваться от 1 до 2 дней или даже несколько недель в зависимости от вируса. Для облегчения обнаружения и подсчета бляшек может потребоваться окрашивание клеточного слоя таким красителем, как нейтральный красный, который окрашивает только живые клетки, или красителем, подобным трипановому синему, который окрашивает только мертвые клетки. Точность анализа бляшек зависит от количества подсчитанных бляшек.

Если на пластине образуется слишком много бляшек, некоторые из них имеют тенденцию сливаться. В результате количество становится меньше, чем должно быть. Многие вирусы образуют острые бляшки, в то время как другие образуют бляшки с диффузным краем.

Опять же, одни вирусы образуют большие бляшки, а другие - маленькие. В зависимости от природы исследуемого вируса необходимо соответствующим образом определить разведение для получения надежных результатов. В случае бактериофагов количество бляшек в чашках пропорционально концентрации вируса, т.е. зависимость между количеством бляшек и концентрацией вируса является линейной.

Другой метод анализа вирусов животных, который использовался ранее, а теперь практически исключен и заменен анализом бляшек, - это анализ pock. В этом методе соответственно разбавленный образец вируса инокулируют в эпителиальный слой хриоаллантоисной мембраны (CAM) куриного эмбриона в курином яйце с зародышем. Характерные инфекционные поражения, называемые оспинами, появляются после инкубационного периода от 36 до 72 часов. Ямки представляют собой непрозрачные области (обычно белые), которые могут располагаться на прозрачном САМ.

Метод определения налета также может быть соответствующим образом модифицирован для подсчета вирусов растений. Для этой цели известный объем правильно разведенного образца растительного вируса наносят на поверхность листа восприимчивого растения-хозяина после того, как лист был механически поврежден, путем легкого протирания поверхности абразивом, таким как карборандум.

После инкубации в течение нескольких дней на листе появляются некротические поражения. Концентрация (титр) вируса может быть рассчитана исходя из количества поражений на единицу площади, коэффициента разведения нанесенного вирусного образца и объема инокулята.

Выращивание вирусов:

Как облигатные паразиты, вирусы нельзя выращивать в неодушевленных искусственных средах, таких как бактерии или грибы. Они могут размножаться только в живых клетках.

(i) Яйцо с зародышем:

Один из самых ранних, но все еще распространенных методов культивирования вирусов животных - это использование оплодотворенных куриных яиц или яиц с зародышем, содержащих молодой (6-12 дней) эмбрион. В разных частях таких яиц могут размножаться разные вирусы животных.

Различные части куриного яйца с эмбрионом показаны на рис. 6.33:

Из различных частей эмбрионального яйца аллантоисная полость и хориоаллантоисная мембрана (ХАМ) используются для культивирования большинства вирусов животных, хотя желточный мешок и эмбрион также используются для некоторых вирусов. CAM инокулирован для выращивания вирусов оспы. В очагах поражения видны серовато-белые пятна. Вирус паротита преимущественно растет в аллантоисной полости. В аллантоисной полости также растут вирус гриппа и вирус бешенства.

Для инокуляции поверхность яйца стерилизуют средством для стерилизации поверхности. В оболочке и оболочке просверливается отверстие, и вирусная суспензия вводится в нужную часть через иглу шприца для подкожных инъекций. Затем отверстие закрывают парафином и инокулируют яйцо в течение 5–12 дней.

(ii) Культуры клеток животных:

Разработка методов культивирования клеток животных in vitro значительно улучшила распространение вирусов животных. Культивируемые клетки животных предоставили количественные методы изучения вирусов животных, сравнимые с методами, применяемыми для изучения бактериальных вирусов. Культуры различного происхождения могут использоваться для культивирования определенных вирусов, потому что, как все вирусы не могут инфицировать и размножаться во всех организмах-хозяевах, так и все вирусы не могут размножаться во всех культурах клеток.

Культивируемые клетки животных во многом отличаются от культур микроорганизмов. Одно из наиболее важных различий заключается в том, что культуры клеток, полученные из нормальных тканей, обычно не выживают при повторном переносе. Через некоторое время они больше не делятся и не умирают. Такие культуры клеток, полученные из тканей хозяина, называются первичными культурами. Первичные культуры, полученные из эмбриональных тканей, способны продолжать рост в течение более длительного времени, чем клеточные культуры, происходящие из взрослых тканей.

Для создания первичной культуры небольшой кусочек ткани животного обрабатывают трипсином для отделения клеток. Трипсин удаляют центрифугированием, и клетки суспендируют. Суспензию помещают в стеклянный или пластиковый контейнер вместе с жидкой средой, такой как среда Игла.

При инкубации клетки прикрепляются к поверхности контейнера и митотически делятся с образованием дочерних клеток, которые распространяются в виде сплошного сплошного роста толщиной в один слой, покрывающего поверхность контейнера (монослой).

Первичные культуры клеток в монослоях можно инокулировать вирусами животных, что приводит к образованию бляшек. С бляшек можно собирать и очищать вирусы. Первичные культуры можно приготовить из различных тканей разных животных. Обычно используемые первичные культуры - это культура клеток почек макаки-резуса, культура клеток фиброластов куриного эмбриона, культура клеток амниона человека и т. Д.

Одно из ограничений первичных клеточных культур состоит в том, что они относительно недолговечны и не могут бесконечно долго сохраняться в субкультурах, подобных культурам микроорганизмов. Отдельные клетки теряют способность делиться после нескольких поколений клеток. Большинство культур клеток человека теряют способность к делению примерно после 50 дупликаций.

Иногда бывает так, что клон, полученный из нормальной клетки первичной культуры, приобретает способность неограниченно расти. Такой клон, обладающий неограниченной способностью к делению, дает клеточную линию. Линия клеток, полученная из первичной культуры, имеет большую долговечность, чем материнская первичная культура, но не является действительно бессмертной.

Во время повторного переноса клеточной линии клон трансформированных клеток может возникать спонтанно. Эти клетки являются раковыми клетками и способны вызывать рак при попадании в правильное животное. Такие трансформированные клетки составляют постоянные клеточные линии. Постоянные клеточные линии могут быть получены непосредственно из культур злокачественных тканей хозяев или они могут быть получены при заражении нормальных культур клеток онкогенными вирусами.

Клетки таких постоянных клеточных линий отличаются по морфологии, ориентации клеток и хромосомному составу от клеток первичных культур и клеточных линий, полученных из них. Различные постоянные клеточные линии были получены из разных тканей и из разных источников, например. шейка матки человека, печень, амнион, почка обезьяны, почка хомяка, соединительная ткань мыши и т. д. Одной из наиболее известных постоянных линий клеток человека являются клетки HeLa, полученные из рака шейки матки афроамериканской женщины по имени Генриетта Лакс.

(iii) Бактериофаги:

Культивирование бактериофагов не представляет трудностей, поскольку они размножаются в растущих бактериях-хозяевах либо в бульоне, либо на затвердевшей среде. Когда инокулят, содержащий литический фаг, добавляется к активно растущей жидкой бактериальной культуре, мутность падает, и культура становится почти прозрачной из-за лизиса клеток. Удаляя остатки клеток центрифугированием, можно получить богатый урожай бактериофага.

Similarly, when a bacterial culture growing in a petridish is inoculated with a phage suspension, the bacteria may be completely lysed, except a few phage resistant colonies. If the number of bacteria far exceeds the number of phages in the inoculum, then individual plaques are formed.

When a temperate bacteriophage Is inoculated into a liquid culture of the appropriate host bacterium, the turbidity decreases transiently and then increases. In agar cultures, the temperate phages produce turbid plaques. Turbid plaques result because a small proportion of the host bacteria undergo the lytic cycle, while the rest enters into lysogenic relationship.

(iv) Plant Viruses:

Plant viruses are generally propagated by direct inoculation of susceptible host plants. Viral inoculum is introduced into the leaf cells by causing artificial mechanical injury, such as rubbing with an abrasive. The viral particles enter through the disrupted cell walls into the cytoplasm of leaf cells where they multiply.

Some viruses, like TMV, may multiply in such great numbers that the progeny TMV particles may account for as much as 10% of the dry weight of the infected tobacco leaves. By disruption of the plant cells and by differential centrifugation TMV can be isolated in mass.

In more recent times, some success has been obtained in cultivating plant viruses in plant protoplast cultures. For example, protoplasts prepared from tobacco leaf mesophyll cells can be infected with TMV. Some plant viruses, like the Rhabdovirus causing necrotic yellow disease of lettuce, can multiply both in the plant host as well as in the insect vector. Such viruses can be grown in the vector cell culture. Lettuce necrotic yellow virus has been successfully grown in monolayers of cell cultures derived from leaf hopper giving an yield of about 10,000 virions per cell.


Cardiovascular Infections

УПРАВЛЕНИЕ

One should attempt virus identification by viral cultures from the blood, stool, or throat washing. Acute and convalescent sera should be compared for serologic titer rise.

Bed rest and limitation in activities are recommended during the acute phase (because exercise intensifies the damage from myocarditis in experimental animals).

Anticongestive measures include the following: a.

Rapid-acting diuretics (furosemide or ethacrynic acid, 1 mg/kg, each one to three times a day).

Rapid-acting inotropic agents, such as dobutamine or dopamine, are useful in critically ill children.

Oxygen and bed rest are recommended. Use of a “cardiac chair” or “infant seat” relieves respiratory distress.

Digoxin may be given cautiously, using half of the usual digitalizing dose (see Table 27-5 ), because some patients with myocarditis are exquisitely sensitive to the drug.

Beneficial effects of high-dose gamma globulin (2 g/kg, over 24 hours) have been reported. The gamma globulin was associated with better survival during the first year after presentation, echo evidence of smaller LV diastolic dimension, and higher fractional shortening compared with the control group. Myocardial damage in myocarditis is mediated in part by immunologic mechanisms, and a high dose of gamma globulin is an immunomodulatory agent, shown to be effective in myocarditis secondary to Kawasaki disease.

Angiotensin-converting enzyme inhibitors, such as captopril, may prove beneficial in the acute phase (as demonstrated in animal experiments).

Arrhythmias should be treated aggressively and may require the use of IV amiodarone.

The role of corticosteroids is unclear at this time, except in the treatment of severe rheumatic carditis (see Chapter 20 ).

Specific therapies include antitoxin in diphtheritic myocarditis.


Isolation and Cultivation of Microorganisms

Microorganisms occur in natural environment like soil. They are mixed with several other forms of life. Many microbes are pathogenic. They cause a number of diseases with a variety of symptoms, depending on how they interact with the patient. The isolation and growth of suspected microbe in pure culture is essential for the identification and control the infectious agent.

The primary culture from natural source will normally be a mixed culture containing microbes of different kinds. But in laboratory, the various species may be isolated from one another. A culture which contains just one species of microorganism is called a pure culture. The process of obtaining a pure culture by separating one species of microbe from a mixture of other species, is known as isolation of the organisms.

Methods of Isolation:

There are special techniques employed to obtain pure cultures of microorganisms. In few cases it is possible to secure pure culture by direct isolation or direct transfer. This can be done only in those situations in which pure culture occurs naturally. Kinds of specimens taken for culturing will depend on the nature and habitat of microbes.

Different pathogens can be isolated from body tissues and fluids such as blood, urine, sputum, pus, faces, spinal fluid, bile, pleural fluids, stomach fluids etc. In the blood stream of a patient suffering with typhoid fever, the bacteria Salmonella typhosa may be present.

A pure culture of this bacterium may be obtained by drawing blood sample using a sterilized hypodermic syringe and treating the blood with anticoagulant such as heparin and potassium oxalate. The presence of the anticoagulant prevents the pathogenic microbe from entrapping in fibrin clot. The sample of the blood may be inoculated into a suitable medium.

Following isolation methods are employed to isolate microbes from mixed cultures:

This is most widely used method of isolation. The technique consists of pouring a suitable sterile medium into sterile petriplate and allowing the medium to solidify. By means of a sterile loope or straight needle or a sterile bent glass-rod a small amount of growth preferably from a broth culture or bacterial suspension is streaked back and forth across the surface of agar until about one third of the diameter of the plate has been covered.

The needle is then flamed and streaking in done at right angles to and across the first streak. This serves to drag bacteria out in a long line from the initial streak. When this streaking is completed the needle is again flamed and streaking is done at right angles to the second streak and parallel to the first.

It includes diluting of a mixture of microorganisms until only a few hundred bacteria are left in each millilitre of the suspension. A very small amount of the dilution is then placed in a sterile petriplateby means of a sterile loop or pipette. The melted agar medium is cooled to about 45°C and is poured into plate. The microorganism and agar are well mixed. When the agar is solidified the individual bacterium will be held in place and will grow to a visible colony.

This method is used for the microorganisms which cannot be easily isolated by streaking or plating method. Sometimes when several organisms are present in a mixture, with one organism predominating, the predominating form may be isolated by this method. For example, when raw milk is allowed to sour at room temperature it will, at the time of curding, have a mixture of microorganisms with high percentage of Streptococcus lactis.

If 1 ml of the sour milk is taken into a tube containing 9 ml. of sterile milk (in which no organisms are present) then 1 ml. of this mixture is transferred with a sterile pipette into a second tube of sterile milk and the procedure is repeated i.e. from second to third tube, third to fourth tube until a series of about 10 tubes are inoculated. By this serial dilution, the chances are that a pure culture of S. lactis will be obtained.

4. Enrichment Procedure:

This procedure involves the use of media and conditions of cultivation which favour the growth of the desired species. For example, when a man suffers with typhoid, the intestinal discharge posses small number of Salmonella typhosa when compared with E. coli and other forms.

It is almost impossible to isolate the typhoid organisms because they represent only a fraction of a per cent of the total microorganisms present. The media are therefore derived, which allow the rapid growth of the desired organisms, at the same time inhibiting the growth of other microorganisms.

This is one of the most ideal and difficult method of securing pure culture. In this method a suspension of the pure culture is placed on the under-side of a sterile cover-glass mounted over a moist chamber on the stage of the micros­cope.

While looking through the microscope, a single cell is removed with the help of sterile micropipette and transferred to a small drop of sterile medium on a sterile cover-glass and is mounted on a sterile hanging drop slide, which is then incubated at suitable temperature. If the single cell germinates in this drop, few cells are transferred into a tube containing sterile culture medium which is placed in the incubator to obtain pure culture originated from single cell.

The isolation of anaerobic microorganisms is very difficult. There are certain special techniques by which these organisms are isolated.

Cultivation of Microorganisms:

For cultivating microbes in laboratory, we require culture media. The various mixtures of nutritive substances used for the laboratory cultivation of microorganisms are collectively known as culture media. The culture media serve as soil in which bacteria are planted for the purpose of study.

Culture Media:

Culture media must contain all the essential nutrients required by the organism for its growth and reproduction. A suitable source of energy, building materials and growth factors must be supplied in adequate amounts.

So a culture medium must contain:

Since microorganisms show a considerable variation in their nutritional requirements, no single medium is suitable for growth of all of them.

The different types of culture media employed fall into three groups:

1. Defined or synthetic media:

These are the media prepared from chemical compounds. They are highly purified and specific, an investigator working in another laboratory can duplicate them.

2. Complex or non-synthetic media:

Media that are prepared from ingredients that have not been precisely defined. It contains hydrolysed proteins and vitamin extracts. This type of medium cannot be duplicated by another worker in another laboratory. Peptone is usually produced by boiling beef, by the hydrolysis of its protein. Casein peptone and milk peptone are also used in complex media as the source of amino acids and nitrogen.

All liquid media, whether complex or synthetic may be converted to solid media by adding either gelat in (a protein) or agar-agar, (a complex polysaccharide) extracted from red marine algae. The use of agar has an advantage. The most bacteria are unable to hydrolyze this molecule into more simple components. Since gelatin is a liquid at room temperature, the use agar allows the medium to remain in a solid form while microbes are growing on its surface.

These are used for the cultivation of viruses. For example, fertilized eggs incubated for 8 to 12 days are able to support the growth of many viruses.

In another classification culture media are grouped into following four types:

1. Natural media:

Includes substances occurring in nature, as 1) Milk 2) Eggs 3) Blood 4) Extract of plant and animal tissues.

2. Derived media:

Includes known substances but the chemical composition of each is unknown. Examples are 1. Nutrient broth (prepared by boiling beef to extract nutrients and adding an amino acid-nitrogen source.) 2. Nutrient agar 3. Nutrient gelatin.

3. Chemically defined media:

Exact chemical composition known.

4. Special media:

Include combinations of the other three types of media.

There are four categories of media used in laboratory:

They are prepared with ingredients that will enhance the growth of certain microbes. Enrichment media encourage the growth of the suspected pathogen so that it will become the most pre-dominant type of microbe in the culture. Two types of enrichment media are blood agar and chocolate agar.

They are prepared with ingredients that inhibit the growth of unwanted microbes which might be in the specimen. The inhibitor may be an antibiotic, salt or other chemical. Mixed culture of microbes originally grown in enrichment media may be inoculated into selective media to isolate the desired microbe.

They are designed to differentiate among microbes. Different bacterial species may produce dissimilar colony colours when grown on differential agar. While in differential broth cultures, the media change colour. Differential media are used to confirm the identity of a microbe that has already been isolated by culturing in enrichment and selective media.

They are used to propagate, or keep microbes growing for a long lime. Samples grown on these media may be taken for analysis. The most common propagation media are nutrient broth and agar.

Preparation of Media:

There are three main steps in the preparation of media:

(a) Preparation as solutions of chemicals and adjusting the pH.

(b) Dispensing the media, and

A broth is prepared by dissolving the appropriate amount of the components in distilled water and pH is adjusted by the addition of either dilute NaOH or Hcl. The broth is dispensed into clean rimless ‘Pyrex’ test tubes which are plugged with non-absorbant cotton wool plugs. The test tubes are placed in wire baskets which are covered with grease proof paper.

The media are sterilized by autoclaving at a temperature of 121 °C and a pressure of 151 b/in 2 for 15 minutes. But medium containing heat- sensitive substances are sterilized either by filtering the solution at room temperature, using bacteria-proof filter or by a process called Tyndallization.

In this method, the liquids are steamed for one hour a day on three consecutive days and the liquids are incubated at 25-30°C. During the first steaming, all the heat sensitive vegetative cells are killed, leaving only the spores. During the first incubation period, most of the spores germinate in to vegetative cells. These vegetative cells are killed by the second steam period.

In the second incubation period, the rest of the spores germinate into vegetative cells which are killed by the third steaming period. In this way, the liquids are sterilized without temperature rising above 100°C.

Maintenance of Pure Culture:

After obtaining the pure culture of a particular microbe, it may be grown and maintained as a pure culture in different ways:

1. The most common practice is to grow the culture on suitable medium until it reaches the stationary phase of growth, and then store in a refrigerator. If they are to be kept alive for a long period all culture must be transferred to a fresh sterile medium. Thus by successive transfer, a culture may be kept for an indefinite period.

2. A second method involves freezing of young culture and desiccating it under vaccum. The cells of a pure culture will remain viable for a long period of time if they are mixed with sterile blood serum, sterile skimmed milk, before freezing and drying. They dried cultures are kept in the sealed, evacuated tubes and are stored in cool places.

3. This method of maintaining pure culture is most suitable for spore forming species. The microorganisms are grown in pure culture in suitable media. A suspension of microorganisms is then transferred to cotton stoppered tubes of sterilized dry soil. The spores remain viable, though dormant, for long periods of time, in dry soil. The organism can be grown after a desired period, by transferring the soil into a suitable medium and incubating it under suitable temperature.


Inoculation of Live Animals

Live animal inoculation is a method used to cultivate viruses.

Цели обучения

Describe live animal innoculation

Ключевые выводы

Ключевые моменты

  • Live inoculation was first used on human volunteers for the study of yellow fever virus.
  • Animals of choice for cultivating viruses include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice.
  • Live animal inoculation requires an experienced personnel to perform various inoculation techniques.

Ключевые термины

  • скрытый: Existing or present but concealed or inactive.
  • oncogenesis: The formation and development of tumors
  • прививка: The introduction of an antigenic substance or vaccine into the body to produce immunity to a specific disease.

Yellow fever virus: A micrograph of the yellow fever virus.

Viruses are obligate intracellular parasites and cannot grow on inanimate media. They need living cells for replication, which can be provided by inoculation in live animals among other methods used to culture viruses (cell culture or inoculation of embryonated eggs). Inoculation of human volunteers was the only known method of cultivation of viruses and understanding viral disease. In 1900, Reed and his colleagues used human volunteers for their work on yellow fever. Due to serious risk involved, human volunteers are recruited only when no other method is available and the virus is relatively harmless. Smallpox was likely the first disease people tried to prevent by purposely inoculating themselves with other infections and was the first disease for which a vaccine was produced. Today, studying viruses via the inoculation of humans would require a stringent study of ethical practices by an institutional review board.

In the past few decades, animal inoculation has been employed for virus isolation. The laboratory animals used include monkeys, rabbits, guinea pigs, rats, hamsters, and mice. The choice of animals and route of inoculation (intracerebral, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, or intraocular) depends largely on the type of virus to be isolated. Handling of animals and inoculation into various routes requires special experience and training. In addition to virus isolation, animal inoculation can also be used to observe pathogenesis, immune response, epidemiology, and oncogenesis. Growth of the virus in inoculated animals may be indicated by visible lesions, disease, or death. Sometimes, serial passage into animals may be required to obtain visible evidence of viral growth. Animal inoculation has several disadvantages as immunity may interfere with viral growth, and the animal may harbor latent viruses.


Definition of Bacterial Isolation

Bacterial isolation is defined as the technique of separating one species of bacteria from the bacteria’s mixed culture by different plating methods like pouring, spreading, streaking, and serial dilution. The growth of bacteria can be observed over the solid nutrient medium, in the liquid broth medium and some automated liquid culture medium. To visualize and isolate the bacteria in solid media, we need to add the bacterial suspension into or on the media.

Oppositely, the bacterial inoculum in the liquid broth is characterized by the turgid media. В automated liquid culture medium also detects bacteria’s presence through various characteristics like production of carbon dioxide. Therefore, bacterial isolation provides an important tool to study the morphological, physiochemical and pathogenic properties of the bacteria that has been isolated.


Isolation and characterization of SARS-CoV-2 from the first US COVID-19 patient

The etiologic agent of the outbreak of pneumonia in Wuhan China in January-2020, was identified as severe acute respiratory syndrome associated coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The first US patient was diagnosed by the State of Washington and the US Centers for Disease Control and Prevention on January 20, 2020. We isolated virus from nasopharyngeal and oropharyngeal specimens, and characterized the viral sequence, replication properties, and cell culture tropism. We found that the virus replicated to high titers in Vero-CCL81 cells and Vero E6 cells in the absence of trypsin. We also deposited the virus into two virus repositories, making it broadly available to the public health and research communities. We hope that open access to this important reagent will expedite development of medical countermeasures.

Article Summary Scientists have isolated replication competent virus from the first US COVID-19 patient. The isolated virus described here will serve as the US reference strain to be used in research, drug discovery and vaccine testing.


Смотреть видео: Cum arată virusurile (December 2022).