Информация

13.3: Патогены в нормальной флоре - Биология

13.3: Патогены в нормальной флоре - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Хотя нормальная флора приносит много пользы для здоровья, некоторые микробы нормальной флоры при определенных обстоятельствах могут вызвать серьезную инфекцию и заболевание. Большинство потенциальных патогенов, обнаруженных в нормальной флоре, являются условно-патогенными микроорганизмами.

Инфекции, вызванные собственной флорой человека, считаются эндогенными. Один из способов возникновения эндогенной инфекции - проникновение бактерии, которая обычно находится в одной части тела, в другую. Примером является Кишечная палочка и другие энтеробактерии. Большинство энтеробактерий могут вызывать раневые инфекции, если попадают на поврежденную кожу, хотя обычно это происходит, когда кто-то находится в ослабленном состоянии. Большинство инфекций мочевыводящих путей вызываются: Кишечная палочка. Кишечная палочка может легко попасть в уретру при пользовании туалетом или во время полового акта (особенно у женщин). Попадая в уретру, многие штаммы Кишечная палочка способны прилипать к мочевыводящим путям с помощью фимбрий и вызывать инфекцию. В редких случаях Кишечная палочка может даже вызвать системные инфекции, такие как менингит или сепсис.

Вириданы Стрептококки обычно находящийся во рту, может вызвать серьезные сердечно-сосудистые заболевания. Если эти бактерии попадают в кровоток (обычно при стоматологической процедуре), они могут осесть и расти на поврежденных сердечных клапанах. Эти наросты называют растениями. Возникающая в результате инфекция - подострый бактериальный эндокардит. Помимо гриппоподобных симптомов (таких как субфебрильная температура, утомляемость, одышка), характерными симптомами этого заболевания являются небольшие болезненные узелки на пальцах рук и ног и крошечные разорванные кровеносные сосуды на белках глаз, нёбо, внутри щёк, на груди или на пальцах рук и ног. После постановки диагноза подострый бактериальный эндокардит обычно легко поддается лечению.

Другой способ, которым микроб может вызвать эндогенную инфекцию, - это ослабление иммунной системы или нарушение нормальной флоры. Нарушение нормальной флоры, как упоминалось выше, может привести к инфекциям с Candida или C. difficile.

Другие примеры условно-патогенных микроорганизмов нормальной флоры, которые могут вызывать эндогенные инфекции, включают:

  • Пневмококк
  • Золотистый стафилококк
  • Haemophilus influenzae

Патогены нормальной флоры также могут инфицировать других людей. Это экзогенные инфекции. Большинство условно-патогенных микроорганизмов нормальной флоры также могут инфицировать другие. Таким образом можно заразиться многими внутрибольничными (связанными со здоровьем) инфекциями.

Иногда человек может бессимптомно переносить первичный патоген в своей флоре. Некоторые патогены, такие как Streptococcus pyogenes а также Neisseria meningitidis может расти только в человеческом хозяине. Иногда люди могут быть носителями этих и других патогенов без каких-либо признаков болезни.


Нормальная респираторная флора как причина внебольничной пневмонии

Фон: Интенсивные исследования не смогли идентифицировать этиологический агент в> 50% случаев внебольничной пневмонии (ВП). Бактериальная пневмония возникает после аспирации признанных бактериальных патогенов (RBP), таких как Пневмококк, Haemophilus influenzae, а также Золотистый стафилококк после колонизации носоглотки. Мы предположили, что аспирация нормальной респираторной флоры (NRF) также может вызывать ВП.

Методы: Мы изучили 120 пациентов, госпитализированных по поводу ВП, которые предоставили высококачественный образец мокроты во время или вскоре после госпитализации с использованием окрашивания по Граму, количественного посева мокроты, бактериального анализа с помощью матричной лазерной десорбции, ионизации, времени пролета и вирусной полимеразной цепной реакции. . Пороги диагностики бактериальной инфекции составляли ≥10 5 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл мокроты для RBP и ≥10 6 КОЕ для NRF.

Полученные результаты: Распознаваемые бактериальные патогены были обнаружены у 68 из 120 (56,7%) пациентов, 14 (20,1%) из них имели сопутствующий респираторный вирус. Нормальная респираторная флора была обнаружена у 31 (25,8%) пациента, 10 (32,2%) имели сопутствующий респираторный вирус. Заражение ≥2 ОДП произошло в 10 случаях, а через НРФ вместе с ОДП - в 13 случаях. Среди NRF организмы, идентифицированные как Стрептококковый митит, которые имеют много общих генетических особенностей S pneumoniae, преобладали. Только респираторный вирус был обнаружен у 16 ​​из 120 (13,3%) пациентов. В целом этиологический диагноз установлен в 95,8% случаев.

Выводы: Нормальная респираторная флора, с вирусной коинфекцией или без нее, по-видимому, вызвала четверть случаев ВП и, возможно, сыграла вспомогательную роль в дополнительных 10,8% случаев, вызванных ОДП. Этиология ВП была выявлена ​​у & gt95% пациентов, которые предоставили высококачественную мокроту во время госпитализации или вскоре после этого.

Ключевые слова: внебольничная пневмония этиологии инфекция нижних дыхательных путей нормальная респираторная флора.

© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени Общества инфекционных болезней Америки.


Абстрактный

Микробиом поверхности кожи и его роль в кожных заболеваниях привлекают все большее внимание в последние годы. Кроме того, есть доказательства непрерывного обмена с кожной иммунной системой в здоровой коже, где волосяные фолликулы (HF) представляют собой уникальные анатомические ниши. В частности, HF на коже черепа образуют большие трубчатые впячивания, которые глубоко проникают в кожу и содержат множество микроорганизмов. Особая иммунология HF с усиленным переносом иммунных клеток в поверхностные компартменты рядом с иммунопривилегированными участками, критически важными для цикла и регенерации волосяных фолликулов, делает этот орган очень восприимчивой структурой. В зависимости от состава и глубины проникновения микробиота может вызывать типичные инфекции, но также может способствовать провоспалительной среде при хронических воспалительных заболеваниях кожи головы. Предполагается участие в регуляции цикла волос и созревании иммунных клеток. Здесь мы рассматриваем последние достижения в области микробиома волосяных фолликулов, иммунологии и исследованиях проникновения, а также обсуждаем клинические последствия для здоровья и болезней кожи головы.


13.3: Патогены в нормальной флоре - Биология

Ключевые слова: бактериология, бактерии, микробиология, микроб, нормальная флора, аборигенные бактерии, кишечная палочка, стафилококк, стрептококк, энтерококк, лактобациллы, бифидобактерии, коринебактерии, клостридий, neisseria, бактероиды, гемофильные бактерии, биопленка, зубной налет, зубной налет болезнь.

Благоприятные эффекты нормальной флоры

Эффекты нормальной флоры выводятся микробиологами на основе экспериментальных сравнений между "стерильными" животными (которые не колонизированы никакими микробами) и обычными животными (которые колонизированы типичной нормальной флорой). Вкратце, некоторые из характеристик стерильных животных, которые, как считается, связаны с отсутствием контакта с нормальной флорой, включают:

1. дефицит витаминов, особенно витамина К и витамина B12
2. повышенная восприимчивость к инфекционным заболеваниям
3. слабо развитая иммунная система, особенно в желудочно-кишечном тракте.
4. отсутствие «естественных антител» или естественного иммунитета к бактериальной инфекции.

Поскольку эти состояния у стерильных мышей и хомяков не встречаются у обычных животных или могут быть улучшены путем введения бактериальной флоры (в соответствующее время развития), можно сделать вывод, что нормальная флора человека вносит аналогичный вклад в развитие человека. питание, здоровье и развитие. Общие положительные эффекты микробов суммированы ниже.

1. Нормальная флора синтезирует и выводит витамины.
превышающие их собственные потребности, которые могут быть усвоены хозяином в виде питательных веществ. Например, у людей кишечные бактерии выделяют витамин К и витамин B12, а молочнокислые бактерии производят определенные витамины группы B. У здоровых животных может быть дефицит витамина К до такой степени, что это необходимо для дополнения их рациона.

2. Нормальная флора предотвращает колонизацию болезнетворными микроорганизмами. конкурируя за места прикрепления или за необходимые питательные вещества. Считается, что это их наиболее важный положительный эффект, который был продемонстрирован в полости рта, кишечнике, коже и эпителии влагалища. В некоторых экспериментах стерильные животные могут быть инфицированы 10 Сальмонелла бактерий, тогда как инфекционная доза для обычных животных составляет около 10 6 клеток.

3. Нормальная флора может противодействовать другим бактериям за счет производства веществ, которые подавляют или убивают некоренные виды. Кишечные бактерии производят множество веществ, от относительно неспецифических жирных кислот и пероксидов до высокоспецифичных бактериоцинов, которые подавляют или убивают другие бактерии.

4. Нормальная флора стимулирует развитие определенных тканей. , то есть слепую кишку и определенные лимфатические ткани (пейеровы бляшки) в желудочно-кишечном тракте. Слепая кишка стерильных животных увеличена, имеет тонкие стенки и заполнена жидкостью по сравнению с этим органом у обычных животных. Кроме того, из-за способности подвергаться иммунологической стимуляции лимфатические ткани кишечника стерильных животных развиты слабо по сравнению с обычными животными.

5. Нормальная флора стимулирует выработку естественных антител. Поскольку нормальная флора ведет себя как антигены у животного, она вызывает иммунологический ответ, в частности, опосредованный антителами иммунный ответ (AMI). Известно, что низкие уровни антител, продуцируемых против компонентов нормальной флоры, перекрестно реагируют с определенными родственными патогенами и тем самым предотвращают инфекцию или инвазию. Антитела, продуцируемые против антигенных компонентов нормальной флоры, иногда называют «естественными» антителами, и такие антитела отсутствуют у стерильных животных.

Вредное действие нормальной флоры

Вредные воздействия нормальной флоры, некоторые из которых наблюдаются в исследованиях на стерильных животных, можно разделить на следующие категории. Все, кроме двух последних, довольно незначительны.

1. Бактериальный синергизм между членом нормальной флоры и потенциальным патогеном. Это означает, что один организм помогает другому расти или выживать. Есть примеры, когда представитель нормальной флоры поставляет витамин или другой фактор роста, необходимый патогену для роста. Это называется перекрестным кормлением микробов. Другой пример синергизма возникает во время лечения «стафилококковых инфекций», когда устойчивый к пенициллину стафилококк, который является компонентом нормальной флоры, разделяет свою лекарственную устойчивость с патогенами, которые в противном случае чувствительны к лекарству.

2. Конкуренция за питательные вещества Бактерии в желудочно-кишечном тракте должны поглощать некоторые питательные вещества хозяина для собственных нужд. Однако в целом они превращают их в другие метаболизируемые соединения, но некоторые питательные вещества могут быть потеряны для хозяина. Известно, что стерильные животные растут быстрее и эффективнее, чем обычные животные. Одним из объяснений включения антибиотиков в корм для свиней, коров и домашней птицы является то, что животное растет быстрее и, следовательно, может быть продано раньше. К сожалению, такая практика способствует развитию и распространению бактериальной устойчивости к антибиотикам как среди сельскохозяйственных животных, так и среди людей.

3. Вызвание токсемии слабой степени. В кровообращении могут быть обнаружены незначительные количества бактериальных токсинов (например, эндотоксина). Конечно, именно эти небольшие количества бактериального антигена стимулируют образование естественных антител.

4. Нормальная флора может быть возбудителем болезни.. Представители нормальной флоры могут вызывать эндогенное заболевание если они достигают участка или ткани, где они не могут быть ограничены или терпимы защитой хозяина. Многие представители нормальной флоры являются потенциальными патогенами, и если они получат доступ к поврежденной ткани, из которой они могут проникнуть, это может привести к заболеванию.

5. Передача уязвимым хозяевам Некоторые патогены человека, которые являются представителями нормальной флоры, также могут полагаться на своего хозяина для передачи другим людям, где они могут вызвать болезнь. Сюда входят патогены, колонизирующие верхние дыхательные пути, такие как Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae а также Золотистый стафилококк, и потенциальные патогены, такие как Кишечная палочка, сальмонелла или Clostridium в желудочно-кишечном тракте.
глава продолжение


Часть 2: Поведение внеклеточного патогена в сообществе

00: 00: 07.14 Привет.
00: 00: 08.20 Меня зовут Ральф Исберг.
00: 00: 09.29 Я профессор молекулярной биологии и микробиологии
00: 00: 12.12 в Медицинской школе Университета Тафтса в Бостоне,
00: 00: 15.20 и я следователь
00: 00: 17.16 Медицинский институт Говарда Хьюза.
00: 00: 19.18 И в этом разговоре
00: 00: 20.23 это второй разговор двоих в этой серии,
00: 00: 23.05 Я хотел бы обсудить поведение сообщества
00: 00: 24.28 внеклеточного патогена в тканях.
00: 00: 27.02 В моем первом разговоре
00: 00: 28.15 Я дал очень простую модель
00: 00: 29.14 для определения того, что отличает патоген от непатогена.
00: 00: 32.14 В этом выступлении вы увидите, что
00: 00: 35.12 различия между патогеном и непатогеном
00: 00: 37.21 не такие четкие,
00: 00: 39.16 и вы увидите, что возбудитель
00: 00: 41.02 может вести себя как непатоген,
00: 00: 43.01 а как возбудитель,
00: 00: 45.00 в тканях хозяина.
00: 00: 46.25 Итак, прежде чем я углублюсь в детали этого выступления,
00: 00: 49.07 Я просто хочу передать вам полезные сообщения,
00: 00: 51.20, который я постараюсь объяснить вам сегодня.
00: 00: 57.17 И первое, что я хотел бы обсудить, это то, что
00: 01: 01.22 экспрессируются патоген-специфические белки
00: 01: 03.15 только небольшая часть бактерий,
00: 01: 06.12 и то, что вы обычно думаете о бактериях, растущих в культуре, таково:
00: 01: 10.03 микроорганизм рождает
00: 01: 12.23 на два генетически идентичных микроорганизма,
00: 01: 15.20 и, кроме того, эти микроорганизмы
00: 01: 17.29 затем дают начало другим организмам
00: 01: 20.04, которые имеют одинаковые профили экспрессии генов
00: 01: 22.26 в качестве первоначальных родителей.
00: 01: 25.05 Это называется однородной популяцией.
00: 01: 27.06 бактерий, растущих в культуре.
00: 01: 29.22 И в чем я хотел бы попытаться убедить вас сегодня
00: 01: 32.13 - это когда бактерии растут в участках тканей
00: 01: 36.04 что, вероятно, это не так.
00: 01: 38.09 Вместо этого, что происходит
00: 01: 40.02 заключается в том, что бактерии могут изначально расти в ткани.
00: 01: 45.09 и быть однородным.
00: 01: 47.13 Затем они иногда вызывают
00: 01: 51.00 бактериальные клетки с другой транскрипцией
00: 01: 54.14 и трансляционный профиль, чем родительский.
00: 01: 57.10 А потом. эти тогда.
00: 01: 59.16 Затем эти организмы продолжают производить больше себе подобных,
00: 02: 02.01, а также порождают другие организмы
00: 02: 04.17, которые могут иметь другие профили транскрипции.
00: 02: 08.28 И поэтому я хочу вас убедить в том, что
00: 02: 12.17 Бактерии, растущие в тканях, транскрипционно неоднородны.
00: 02: 18.22 Второе, в чем я хотел бы вас убедить, это то, что
00: 02: 21.08 одна из причин такой неоднородности экспрессии генов.
00: 02: 24.16 заключается в том, что микросреда, в которой эти организмы растут
00: 02: 27.08 контролирует профиль экспрессии бактериальных генов,
00: 02: 29.19 и это видно на этом слайде.
00: 02: 31.07 То, что я пытаюсь вам описать
00: 02: 34.01 - это разные микросреды, с которыми может столкнуться микроорганизм.
00: 02: 38.03 Когда организм растет
00: 02: 40.25 и выходит из одной микросреды
00: 02: 44.24 Затем он сталкивается с другой микросредой,
00: 02: 47.22, и это вызывает переключение профиля транскрипции
00: 02: 50.18, так что теперь он принимает профиль транскрипции
00: 02: 53.26, что подходит для данной микросреды.
00: 02: 58.06 Ошибки будут продолжать расти и расширяться.
00: 03: 00.12, а затем они столкнутся с другими микросредами,
00: 03: 02.29 где они также, аналогичным образом,
00: 03: 05.16 реагируют на эту микросреду.
00: 03: 08.15 И еще я хотел бы отметить еще одну вещь.
00: 03: 11.22 и это то, что есть поведение сообщества.
00: 03: 14.29 Итак, каково поведение сообщества?
00: 03: 16.26 И поведение бактерий в сообществе
00: 03: 18.26 такова, что бактерии изменят микросреду.
00: 03: 21.16 в котором могут расти другие бактерии,
00: 03: 24.14 и это изменение может быть вызвано разными причинами.
00: 03: 28.18 Один из способов, которым может произойти это изменение
00: 03: 30.23 состоит в том, что организмы могут выделять молекулы
00: 03: 33.19 которые меняют микросреду,
00: 03: 36.13 и другие бактерии способны реагировать на эти молекулы.
00: 03: 39.16 Но есть и другие способы, которыми это может произойти,
00: 03: 41.20 в котором микроорганизм действительно способен изменять окружающую среду
00: 03: 46.15 и истощить определенные молекулы, находящиеся в микросреде,
00: 03: 51.02, а затем сгенерировать совершенно новую среду
00: 03: 53.05 в котором молекулярные аспекты окружающей среды
00: 03: 55.10 отличаются от оригинала.
00: 03: 57.12 Таким образом, новые бактерии, которые растут в этой новой среде,
00: 04: 00.12 имеют разные профили транскрипции,
00: 04: 02.19, которые позволяют им реагировать на эту новую микросреду.
00: 04: 08.28 Хорошо.
00: 04: 10.26 Итак, история, которую я хочу вам рассказать, касается организма,
00: 04: 12.22 Yersinia pseudotuberculosis.
00: 04: 15.03 Это называется кишечным организмом.
00: 04: 16.17 потому что это вызывает болезнь
00: 04: 18.16 из-за проглатывания зараженных пищевых продуктов.
00: 04: 20.24 Организм представляет собой грамотрицательную палочку.
00: 04: 23.14 То есть это организм
00: 04: 25.00, который не оставляет пятен по Граму.
00: 04: 27.16 Я показал это красным,
00: 04: 29.05 как обычно микробиологи
00: 04: 31.22 Отображение грамотрицательных стержней.
00: 04: 34.10 А потом. болезнь, которая вызывается у людей
00: 04: 36.28 часто приводит к росту регионарных лимфатических узлов.
00: 04: 40.22 в кишечнике.
00: 04: 42.20 Это называется брыжеечным аденитом.
00: 04: 46.03 В лаборатории мы моделируем это заболевание на мышах.
00: 04: 50.25 Итак, с мышами,
00: 04: 52.16 происходит то, что мы позволяем им перорально проглотить организм,
00: 04: 55.10 или введем организм внутривенно,
00: 04: 59.23, а затем по любому маршруту
00: 05: 02.10 организм проникнет в глубокие участки тканей
00: 05: 04.27 и растут в селезенке.
00: 05: 07.11 Эта конкретная болезнь имитирует то, что мы называем
00: 05: 10.13 инвазивные заболевания,
00: 05: 12.04, при котором организмы перемещаются с одного участка ткани на другой.
00: 05: 14.26 В этом случае участок ткани, по которому движется организм
00: 05: 17.11 - из кишечника
00: 05: 19.10 в более глубокие участки ткани, такие как селезенка.
00: 05: 22.20 Мы интересовались этим процессом уже несколько лет,
00: 05: 26.00 и то, как мы на это смотрим
00: 05: 28.05 - организм сначала попадает в кишечник,
00: 05: 30.26 и то, что я показываю, это диаграмма
00: 05: 33.09 как выглядит тонкий кишечник.
00: 05: 35.23 В тонком кишечнике есть крипты,
00: 05: 38.11, у которых есть свои специфические клетки-крипты.
00: 05: 40.29 В нем есть микроворсинки
00: 05: 43.07, которые связаны с ячейками.
00: 05: 45.05 Затем есть ворсинки,
00: 05: 48.09, который находится наверху.
00: 05: 50.02 Кроме того, есть регионарные лимфатические узлы,
00: 05: 51.21 и региональные лимфатические узлы, с которыми мы больше всего знакомы.
00: 05: 54.25 с которыми мы работаем,
00: 05: 56.21 - регионарные лимфатические узлы, называемые пейеровыми бляшками,
00: 05: 58.20, а также мезентериальные лимфатические узлы,
00: 06: 00.16 и мезентериальный лимфатический узел
00: 06: 02.08 - это небольшой узел, который впадает в пятна Пейера.
00: 06: 05.29 Итак, кишечный эпителий,
00: 06: 07.27 просвет кишечника,
00: 06: 09.14 и эти регионарные лимфатические узлы
00: 06: 11.04 - участки, которые могут подвергаться воздействию организма,
00: 06: 13.19 если организм может двигаться
00: 06: 16.02 из просвета кишечника
00: 06: 18.15 в эти участки ткани.
00: 06: 20.16 И это известно уже много лет,
00: 06: 23.23 на самом деле с 1950-х годов,
00: 06: 25.20, когда организм попадает в организм хозяина
00: 06: 28.08 организм может перемещаться в оба этих участка ткани.
00: 06: 32.03, которые связаны с кишечником,
00: 06: 34.06, а также на более глубоких участках тканей, таких как селезенка.
00: 06: 37.16 Изначально мы заинтересовались этим
00: 06: 39.14 несколько лет назад,
00: 06: 41.12 Пенелопа Барнс, доктор медицинских наук, работающий в моей лаборатории,
00: 06: 44.16 который в настоящее время является специалистом по инфекционным заболеваниям
00: 06: 47.04 в Университете Орегона,
00: 06: 49.17 было интересно, когда бактерии проникают в эти регионарные лимфатические узлы,
00: 06: 52.28 будут ли они стекать из регионарных лимфатических узлов в глубокие участки тканей.
00: 06: 57.08 И она получила очень удивительный результат.
00: 06: 59.21 И она обнаружила, что
00: 07: 01.19 бактерии, которые растут в этих регионарных лимфатических узлах
00: 07: 03.28 на самом деле другая популяция бактерий.
00: 07: 06.21 чем те, которые способны расти
00: 07: 09.00 на участках глубоких тканей.
00: 07: 11.17 Итак, как мы смотрим на организм,
00: 07: 13.06 Начальными аспектами болезни являются следующие:
00: 07: 16.16 из-за учебы.
00: 07: 18.05 Бактерии проникают внутрь.
00: 07: 20.05 воспринимаются хостом, в данном случае мышью.
00: 07: 23.09 Затем организм будет перемещаться по эпителию.
00: 07: 29.17 Он перемещается через особую клетку, называемую М-клеткой,
00: 07: 32.13, которые находятся на поверхности пятен Пейера,
00: 07: 34.28, а затем войдет в патч Пейера.
00: 07: 36.28 И мы считаем, что когда-то организм
00: 07: 39.22 находится в патче Пейера,
00: 07: 41.20 иммунный ответ будет держать репликацию под контролем,
00: 07: 45.01 и даже если вы увидите очень большие болюсы роста
00: 07: 47.28 организма на этом сайте,
00: 07: 49.20 организм не истощается
00: 07: 51.20 дальше от участка в участки глубоких тканей.
00: 07: 53.24 Может стекать с пейеровых пятен.
00: 07: 55.23 в мезентериальный лимфатический узел,
00: 07: 57.19 но там это ограничено
00: 07: 59.11 и иммунный ответ очень эффективен
00: 08: 01.03 в удержании организма от дальнейшего движения
00: 08: 04.00 в глубокие ткани.
00: 08: 05.23 Вместо этого происходит какой-то загадочный процесс,
00: 08: 08.06 и мы до сих пор не знаем, что это такое,
00: 08: 10.05 в котором организм способен
00: 08: 12.24 перемещаются по кишечному эпителию.
00: 08: 14.29 это можно увидеть здесь.
00: 08: 16.27 и затем может попасть в кровоток,
00: 08: 20.09 и затем один раз в кровотоке,
00: 08: 21.23 организм пробивается
00: 08: 23.25 в глубокие участки тканей, такие как печень и селезенка.
00: 08: 25.24 Итак, мы смотрим на эту болезнь как на пару разных вещей.
00: 08: 28.03 происходящие одновременно:
00: 08: 30.01 инфекция, возникающая в регионарных лимфатических узлах,
00: 08: 32.06 и инфекция, которая возникает в глубоких тканях.
00: 08: 34.24 На самом деле, общения почти не происходит.
00: 08: 36.27 между этими двумя регионами узла сети.
00: 08: 43.09 Теперь на участке глубоких тканей.
00: 08: 45.19 это микрофотография моего
00: 08: 47.22 близкий коллега Джоан Мечас,
00: 08: 49.17, который работает в Медицинской школе Тафтса.
00: 08: 51.19 это разрез селезенки.
00: 08: 53.27 Вверху находится раздел
00: 08: 56.00, когда животное было усыплено.
00: 08: 58.14 Селезенка заморожена, взяты замороженные срезы.
00: 09: 01.17 А еще гистологическое окрашивание
00: 09: 04.12, что позволяет обнаруживать бактерии,
00: 09: 07.10 и если вы посмотрите на большее увеличение,
00: 09: 09.08 вы можете увидеть эти очаги репликации,
00: 09: 12.01 и темные точки окрашивают
00: 09: 15.03 репликация Yersinia pseudotuberculosis.
00: 09: 17.09 Нам стало очень любопытно
00: 09: 18.28 о природе этих черных пятен.
00: 09: 21.00 Как они могут вызвать болезнь?
00: 09: 23.00 И как они распространяются по селезенке?
00: 09: 27.02 Итак, что значит колонизировать ткань?
00: 09: 29.15 Итак, исходный вид, который у нас был
00: 09: 31.16 из работы Пенелопы Барнс несколько лет назад в моей лаборатории,
00: 09: 34.26 было то, что некоторые клетки бактерий
00: 09: 36.27 засевали селезенку.
00: 09: 39.14 Итак, обычно она видит от 1 до 4 ячеек.
00: 09: 42.03 первоначальный посев селезенки,
00: 09: 44.01 и, конечно же, бактерии продолжат свое существование.
00: 09: 45.26, чтобы убить хозяина за счет неослабевающей репликации организма.
00: 09: 49.07 на этом участке ткани.
00: 09: 51.08 Итак, один из способов взглянуть на это
00: 09: 53.01 заключается в том, что эти несколько организмов продолжают жить
00: 09: 54.29 как будто селезенка - это просто бульонная культура
00: 09: 59.05 и они продолжают расти
00: 10: 01.14 как будто селезенка - это бульонная культура,
00: 10: 03.08, а затем в конечном итоге сокрушит селезенку.
00: 10: 09.03 Один из способов взглянуть на это
00: 10: 10.26 это очень похоже на посев бульонной культуры
00: 10: 13.27 в лаборатории.
00: 10: 15.25 Итак, это мой коллега.
00: 10: 17.20 А вот и колония с тарелки
00: 10: 19.13, а затем посев в бульонную культуру.
00: 10: 22.03 Это похоже на прививку
00: 10: 23.29 селезенки, возникающей после проникновения бактерий из кишечника.
00: 10: 27.18 и войдите в глубокие участки тканей.
00: 10: 30.13 Затем, как только бактерии попадают в селезенку,
00: 10: 32.07 в данном случае мы имитировали это
00: 10: 33.24 при выращивании в бульонной культуре,
00: 10: 35.22 бактерии будут расти,
00: 10: 38.02, поскольку иммунный ответ не может ограничить репликацию организма,
00: 10: 41.13 в конце концов, это патоген.
00: 10: 43.12 Организм может расти в культуре.
00: 10: 45.17, а затем мы видим однородную культуру бульона в участках ткани.
00: 10: 49.14 Итак, это одна модель,
00: 10: 51.02 и я должен признаться,
00: 10: 52.27 Я так думал несколько лет.
00: 10: 55.19 Однако есть и другая модель.
00: 10: 57.13 что может показаться вам более очевидным,
00: 10: 59.13 но для меня это было незаметно,
00: 11: 01.18 и бактерии
00: 11: 03.13 изначально засевали селезенку,
00: 11: 05.28 между 1 и 4 ячейками,
00: 11: 08.10, а затем каждая из этих ячеек
00: 11: 10.16 дали начало отдельным колониям.
00: 11: 13.12 Итак, болезнь была вызвана колонизацией.
00: 11: 17.07 через ряд независимых колоний, образующихся в участках тканей.
00: 11: 21.23 Это также можно было воспроизвести в лаборатории.
00: 11: 26.13 Итак, вот вы видите моего коллегу,
00: 11: 29.27 инокуляция чашки Петри.
00: 11: 32.07 Опять же, это похоже на то, что мы могли бы увидеть
00: 11: 34.17 с посевом селезенки.
00: 11: 36.16 Бактерии изначально попадают в организм хозяина.
00: 11: 40.13 Тогда организм, значит,
00: 11: 42.14 разжижается и затем попадает в селезенку,
00: 11: 44.04, а затем отдельные клетки засевают селезенку.
00: 11: 46.20 В данном случае это будет чашка Петри.
00: 11: 48.28 Затем, когда чашке Петри позволят инкубироваться
00: 11: 51.05 на соответствующее время,
00: 11: 54.19 на чашке Петри появляются отдельные колонии.
00: 11: 57.18 Итак, вопрос в том,
00: 11: 59.18 мы получаем культуру бульона, растущую в селезенке,
00: 12: 02.13 или бактерии растут в форме чашки с агаром?
00: 12: 05.13 Итак, это очень простой эксперимент.
00: 12: 07.12 и то, как мы различаем эти две модели
00: 12: 09.12 выглядит следующим образом.
00: 12: 11.17 Берем два штамма бактерий.
00: 12: 13.22, которые генетически идентичны
00: 12: 16.05 за исключением того, что они отличаются одним геном.
00: 12: 18.03 У одного есть флуоресцентный белок под названием mCherry,
00: 12: 20.29 который светится красным, как вы можете себе представить,
00: 12: 23.14, а в другом - флуоресцентный белок.
00: 12: 25.23, который светится зеленым, называется GFP.
00: 12: 28.26 Берем эти две бактериальные культуры.
00: 12: 31.23 а затем смешиваем их все
00: 12: 33.21 Итак, у нас есть культура, полная красных и зеленых бактерий.
00: 12: 37.14 Пожалуйста, извините за использование красного и зеленого, если вы дальтоник
00: 12: 40.12 Я постараюсь поговорить об этом за вас.
00: 12: 43.02 А затем возьмем эту смешанную культуру.
00: 12: 45.23, а затем мы вводим его внутривенно животному.
00: 12: 50.01 несколько сотен или несколько тысяч бактерий попали в животное.
00: 12: 53.15 А затем мы позволяем некоторым бактериям посеять
00: 12: 55.18 участок глубоких тканей.
00: 12: 58.11 Итак, здесь мы взяли i.v. прививка,
00: 13: 00.16 и мы используем мышь,
00: 13: 02.04 а потом усыпляем мышь,
00: 13: 03.03 а потом анализируем селезенку
00: 13: 04.29 путем взятия замороженных участков селезенки
00: 13: 08.11 а потом смотрю на эти замороженные участки
00: 13: 11.02 в флуоресцентном микроскопе.
00: 13: 16.24 И вы понимаете,
00: 13: 18.16 очень очевидный результат.
00: 13: 20.13 Это победа модели чашки с агаром.
00: 13: 23.10 Итак, как вы можете видеть прямо здесь, если у нас есть зеленая колония,
00: 13: 25.18 это не смешано.
00: 13: 27.04 Если у нас красная колония, она не смешанная.
00: 13: 29.12 Вы можете увидеть некоторое распространение зеленых ячеек.
00: 13: 31.23 в другие участки ткани,
00: 13: 33.19 но вы не видите смесь красного и зеленого.
00: 13: 36.01 Итак,
00: 13: 37.18 что происходит, когда бактерии высеваются
00: 13: 39.15 в селезенку,
00: 13: 40.28 это как если бы они были посеяны на чашку с агаром.
00: 13: 42.29 Отдельные бактерии
00: 13: 44.17 формируются отдельные колонии,
00: 13: 47.10 и, похоже, никакого смешения не происходит
00: 13: 49.10 между колониями.
00: 13: 50.23 После основания колонии
00: 13: 52.07 Кажется, бактерии могут мигрировать
00: 13: 54.07 из этой колонии в другие места,
00: 13: 56.00 и установить другие колонии в ткани.
00: 13: 58.28 Хорошо, а теперь.
00: 14: 03.04 Когда вы посмотрите на это, вы увидите, что есть проблема.
00: 14: 05.16 Как я уже упоминал в первом разговоре,
00: 14: 07.16 мы отличаем патогены от непатогенов
00: 14: 10.06 белками вирулентности, производимыми патогенами.
00: 14: 13.25 А от чего зависит, будет ли возбудитель
00: 14: 15.21 сделает белок вирулентности
00: 14: 17.02 - действительно ли он взаимодействует напрямую с тканями хозяина.
00: 14: 20.24 Но здесь вы можете увидеть, когда образуется колония,
00: 14: 23.08 Не все бактерии взаимодействуют с клетками-хозяевами.
00: 14: 26.06 У нас есть бактерии внутри этих маленьких колоний,
00: 14: 28.20 и все, что они видят, это другие бактерии в колонии,
00: 14: 31.26 а у нас есть другие бактерии
00: 14: 33.18 где они на периферии этой колонии,
00: 14: 35.14, и они явно взаимодействуют с клетками-хозяевами.
00: 14: 38.02 И клетки-хозяева, которые мы видим, окружающие эти бактерии,
00: 14: 40.19 и это будет продемонстрировано позже в этом выступлении,
00: 14: 43.08 эти клетки-хозяева - нейтрофилы,
00: 14: 45.23 фагоцитарные клетки, которые пытаются уничтожить микроорганизм,
00: 14: 49.13, и нейтрофилы отображаются здесь синим цветом.
00: 14: 53.08 Они отображаются здесь синим цветом
00: 14: 56.05, потому что мы окрасили их ядра красителем ДНК.
00: 14: 58.16 Хорошо, теперь вопрос в том,
00: 15: 00.08 что это за бактерии
00: 15: 02.03 в этих разных средах?
00: 15: 03.16 Они по-другому ведут себя?
00: 15: 07.09 Итак, когда мы смотрим на это,
00: 15: 08.28 явно что-то происходит.
00: 15: 10.20 Первое, что вы замечаете в этом конкретном участке ткани.
00: 15: 13.17 - это то, что мы набрали нейтрофилы на этот сайт,
00: 15: 16.03 и бактерии все еще живы.
00: 15: 18.11 Кроме того, вы видите, что
00: 15: 20.13 бактерии сталкиваются с фагоцитарной клеткой,
00: 15: 23.06 и есть подмножество бактерий
00: 15: 25.07, которые взаимодействуют с фагоцитарной клеткой,
00: 15: 27.05 но бактерии не фагоцитируются
00: 15: 29.04 они просто привязаны к поверхности.
00: 15: 31.01 Второе, что вы заметили, это то, что
00:15:32.25 there are bacteria within this colony,
00:15:34.28 which are not interacting with the phagocytic cells at all.
00:15:37.11 So the question is, why are you.
00:15:39.10 why do you have one set of bacteria
00:15:41.06 directly interacting with host cells,
00:15:42.28 and the other one that seems to be naive to these cells.
00:15:47.12 So, clearly this pathogen
00:15:49.22 is doing something to the phagocyte.
00:15:51.11 It's preventing phagocytosis.
00:15:53.25 The way it does that
00:15:56.19 is it has a Type III secretion system.
00:15:59.03 A Type III secretion system
00:16:00.21 is one of the specialized secretion systems
00:16:02.21 which I described in the previous talk,
00:16:04.24 and the Type III secretion system
00:16:06.24 allows movement of a protein into the host cell,
00:16:10.17 which interferes with phagocytosis.
00:16:13.05 And the way that these proteins
00:16:14.22 are able to move from the bacterium
00:16:16.26 into the host cell
00:16:18.16 is through this needle-like structure
00:16:20.02 which is on the surface of the bacterium,
00:16:22.02 in which bacterial proteins
00:16:24.29 which interfere with phagocytosis of the host cell
00:16:27.10 move through this structure,
00:16:29.12 across the plasma membrane of the host cell,
00:16:31.06 and then are able to get a cytoplasmic target.
00:16:34.08 target a cytoplasmic protein
00:16:36.29 within the host phagocyte.
00:16:39.04 This is.
00:16:41.15 the structure of these particular secretion complexes
00:16:45.17 was initially described in Jorge Galán's lab,
00:16:50.09 and there's some beautiful structures
00:16:52.10 that have been now demonstrated
00:16:55.09 in the lab of Marlovits and coworkers,
00:16:57.13 and this is an EM structure of such a complex.
00:17:01.02 As you can see, there's a base
00:17:03.22 which is through the envelope of the bacterial cell
00:17:06.08 and then there's this needle
00:17:08.02 which sticks out from the surface of the bacterial cell
00:17:10.08 into the host cell.
00:17:14.29 Alright, so now the secreted protein
00:17:16.24 goes through the Type III translocation apparatus,
00:17:20.02 and what's probably the most important protein
00:17:21.29 for this process
00:17:23.22 is the protein YopE,
00:17:25.17 which is one of these proteins
00:17:27.01 that targets small GTPases in the host cell
00:17:28.24 and inactivates Rho family members
00:17:30.17 to prevent phagocytosis.
00:17:32.11 So, what you see here
00:17:33.25 is YopE is being secreted by the bacterium.
00:17:36.19 It's now interfering with phagocytosis
00:17:38.17 by the neutrophils that are surrounding the [bacterial] cell,
00:17:42.02 and then you see this frustrated phagocytosis event.
00:17:45.06 On the other hand, the bacteria which are within the colony
00:17:48.13 do not have to deal directly with the phagocyte,
00:17:50.26 therefore they may not need
00:17:53.16 the transcriptional program
00:17:55.23 which makes these proteins
00:17:57.23 which have to inactivate the neutrophil.
00:18:02.04 So what we wanted to ask then is,
00:18:05.07 is there spatial regulation?
00:18:07.09 So, do the bacteria which interact directly with the neutrophil
00:18:10.02 have a different transcriptional profile
00:18:12.00 than the bacteria which are growing
00:18:14.05 within the center of these host cells.
00:18:16.25 And so.
00:18:18.18 we believe that that's probably the case,
00:18:20.15 and we had reason to believe this was the case
00:18:22.13 based on previous work from workers studying
00:18:25.29 organisms growing within the lumen of the intestine.
00:18:28.13 And, in this particular work,
00:18:30.02 which was done by Sansonetti and coworkers.
00:18:32.20 Christoph Tang.
00:18:34.21 what they did is they fed another pathogen, Shigella flexneri,
00:18:38.16 into animals,
00:18:41.00 and they noticed that bacteria
00:18:43.00 that were growing near the interface of intestinal epithelium,
00:18:45.19 and in the lumen,
00:18:47.19 seemed to be seeing a different environment
00:18:50.00 in regards to oxygen tension.
00:18:52.11 And the way this could be seen
00:18:54.20 is with one of these fluorescent proteins, GFP,
00:18:56.26 which only folds if you have sufficient oxygen in the environment.
00:18:59.15 And what they found is that,
00:19:01.19 in the case of these GFP-encoding Shigella,
00:19:04.28 bacteria which were growing within the lumen did not fluoresce,
00:19:08.23 but as you got closer and closer to the lumen of the intestine,
00:19:11.29 what happens is they begin to fluoresce,
00:19:14.09 and the reason why is because the oxygen tension here,
00:19:16.21 near the intestinal epithelial cells,
00:19:19.12 is much higher than in the lumen of the intestine,
00:19:21.24 which is basically anaerobic,
00:19:23.27 and the GFP will not fold.
00:19:28.19 And so this colored our way of looking at things.
00:19:32.20 And so we asked if a similar thing could be going on,
00:19:35.02 but it's a little different than the oxygen environment.
00:19:37.04 What we're seeing here is we're seeing a cell interactive environment
00:19:40.22 as well as an environment
00:19:43.01 in which the bacteria are growing within the center.
00:19:46.28 So now, the second thing that we were interested in, then,
00:19:49.19 is whether there is community behavior.
00:19:52.01 And, we defined community behavior by the following,
00:19:54.09 and that is that the activity of one population
00:19:56.28 causes a second population to be differentially regulated.
00:20:00.01 So, as you recall from the early slides,
00:20:02.08 bacteria which would be growing associated with tissues,
00:20:05.17 in this case neutrophils,
00:20:08.11 might change the environment,
00:20:10.09 so that the bacteria growing within the center of the colony
00:20:12.15 then are experiencing a different environment
00:20:16.20 and, as a result of this different environment then,
00:20:19.02 they undergo a different transcriptional profile
00:20:21.19 that looks very different from the bacteria
00:20:23.17 which are growing associated with host cells.
00:20:28.00 Okay, so let's go and talk about the first point.
00:20:31.25 And again, YopE will interact with the phagocyte.
00:20:35.00 interfere with phagocytosis.
00:20:37.00 And so, one of the interesting aspects of the regulation
00:20:40.12 of the gene that encodes this protein
00:20:43.10 is that it has been shown by Hans Wolf-Watz and coworkers,
00:20:46.03 almost twenty years ago,
00:20:49.25 that the gene for this protein is upregulated,
00:20:54.03 so the gene is transcribed at higher levels,
00:20:56.25 when bacteria are growing in contact with host cells
00:20:59.24 than when they're not.
00:21:01.08 In this simple experiment from Wolf-Watz's lab,
00:21:03.19 he takes bacteria in which a luciferase reporter
00:21:05.27 is fused to the gene for YopE
00:21:08.07 and then incubates it with cultured cells,
00:21:10.22 in this case it's HeLa cells,
00:21:12.24 and then the bacteria which are associated
00:21:16.01 simply with the extracellular matrix are not turning on this gene,
00:21:18.15 but those which are associated with the cells are.
00:21:21.22 So then what we asked is,
00:21:23.21 is this really what's going on in tissues?
00:21:27.27 And so, we made a similar type of reporter,
00:21:30.17 and this reporter actually has two different fluorescent proteins in it.
00:21:33.23 One fluorescent protein has GFP,
00:21:36.23 and GFP is just made constitutively,
00:21:38.29 so it's always on,
00:21:40.28 and the other has Cherry.
00:21:43.04 Cherry is a red fluorescent protein,
00:21:44.25 and it's under the transcriptional control
00:21:46.24 of the YopE gene.
00:21:48.20 Otherwise, this organism is totally wild type.
00:21:51.23 It has all the components necessary
00:21:53.28 for causing disease.
00:21:56.00 Then, we take this particular construct,
00:21:57.29 we then inject animals intravenously,
00:22:00.27 we allow infection to go on for three days,
00:22:03.19 we then harvest the spleens
00:22:05.16 and we perform histology on frozen sections,
00:22:07.26 using fluorescence microscopy.
00:22:11.03 Usually, we use confocal microscopy to do this.
00:22:16.12 And you see a very striking result.
00:22:18.19 Again, red is the YopE gene.
00:22:20.23 Green is just constitutive expression.
00:22:23.06 And what you can see is that on the edges of these colonies
00:22:26.05 the bacteria are glowing red.
00:22:28.19 If they're in contact with the host cells,
00:22:30.04 with the neutrophils,
00:22:31.18 they're turned on.
00:22:33.13 But the bacteria in the center have a different transcriptional profile
00:22:35.29 they're green.
00:22:37.15 They're not turning on this gene,
00:22:39.02 so they're in a protective environment
00:22:40.21 in which they're not directly interacting with phagocytic cells.
00:22:43.24 They're growing, in essence,
00:22:45.16 in some ways,
00:22:47.06 very similarly to bacteria which are not growing in tissue.
00:22:53.16 So, there's the contact with the host cells,
00:22:56.02 and those are the bacteria that are internal.
00:22:59.18 Now, this gives us
00:23:02.09 two transcriptionally distinct populations,
00:23:07.17 and it's clear that it looks like there's an altruistic effect,
00:23:10.27 so that the bacteria directly interacting
00:23:13.06 with the host cells
00:23:14.25 are changing the environment
00:23:16.17 so that the bacteria in the center
00:23:18.25 are able to actually avoid phagocytosis.
00:23:21.13 And not only does avoid phagocytosis mean that they don't have to worry
00:23:24.16 about being killed by the phagocyte,
00:23:26.20 it means they can undergo a transcriptional profile
00:23:29.02 which starts to look a little bit like what a non-pathogen
00:23:31.15 looks like, in that they may not be making some of the genes that are.
00:23:35.20 expressing some of the genes that are important for disease.
00:23:41.24 But the question is, there's other things going on in tissue,
00:23:44.14 and I mentioned in the previous talk,
00:23:47.11 when these foci start to get larger,
00:23:51.14 what happens is there are secondary responses
00:23:53.24 in which the host tries to clear out microorganisms.
00:23:56.21 And one of the secondary responses is nitric oxide.
00:23:59.20 So, there's cells that might come in
00:24:01.22 and make soluble mediators
00:24:03.22 to actually start to clear out the organism.
00:24:06.05 So what we wanted to ask is,
00:24:07.28 is this more heterogeneous than we even though initially?
00:24:10.20 Is there actually more than one population?
00:24:15.00 So, nitric oxide,
00:24:17.20 as I mentioned previously,
00:24:20.08 would be a very important antimicrobial molecule
00:24:22.29 that these cells might see.
00:24:25.06 It can diffuse into the center of these microcolonies,
00:24:28.00 and so the bacteria don't actually have to
00:24:30.06 directly interact with phagocytes
00:24:32.05 in order to see this antimicrobial molecule.
00:24:34.23 And nitric oxide, of course,
00:24:36.22 is made by inducible nitric oxide synthase.
00:24:40.27 So, now we believe that
00:24:45.24 Yersinia has to have strategies for dealing with nitric oxide,
00:24:48.27 and the reason for believing
00:24:51.00 is that the very closely related,
00:24:53.02 shockingly closely related organism, Yersinia pestis,
00:24:55.10 which causes bubonic plague.
00:24:57.08 but causes a disease that's very different
00:24:59.27 from Yersinia pseudotuberculosis.
00:25:02.25 appears to require strategies
00:25:04.20 for dealing with the nitric oxide response.
00:25:07.18 And in enteric organisms,
00:25:09.11 that is, Gram negative organisms
00:25:11.12 which are similar to E. coli,
00:25:13.22 the most important way in which these organisms
00:25:15.19 are able to inactive nitric oxide
00:25:18.15 is through the use of this protein called HMP,
00:25:20.23 which is a flavoprotein which inactivates nitric oxide.
00:25:24.13 And what Sebbane and coworkers showed
00:25:26.11 a number of years ago
00:25:28.16 is that if you don't have HMP,
00:25:30.23 then Yersinia pestis,
00:25:32.20 which causes a lethal disease in mice,
00:25:36.10 shows delayed or no death in other animals
00:25:40.10 if the bacteria are unable to make the HMP protein.
00:25:44.03 So, we decided to investigate this in detail,
00:25:46.27 and there were reasons for thinking that HMP
00:25:48.27 would be an important protein to look at,
00:25:51.02 because hmp is a gene
00:25:53.02 that's highly regulated by the presence of nitric oxide.
00:25:58.17 So, in bacteria,
00:26:00.22 nitric oxide is able to regulate a number of genes.
00:26:04.02 The HMP protein,
00:26:05.29 which takes nitric oxide and oxygen
00:26:08.11 and inactivates it by making NO3-,
00:26:11.03 is a flavoprotein as described right here,
00:26:13.29 and it's regulated by a transcriptional regulator
00:26:17.17 called NsrR, which recognizes
00:26:20.26 high levels of nitric oxide in tissues,
00:26:24.00 and then there's a conformational change in NsrR
00:26:27.08 which activates the gene for HMP,
00:26:29.12 and it then gets turned on.
00:26:31.08 That means we can use the gene for HMP
00:26:33.08 as a reporter for nitric oxide concentration
00:26:35.20 in host tissues.
00:26:39.09 So, the reporter we made was very similar
00:26:41.06 to the one we showed before,
00:26:43.00 and that is that we have a constitutively expressed GFP
00:26:45.14 and then we have Cherry under the control of the hmp gene.
00:26:50.10 So, what we see is something very similar
00:26:52.09 to what we saw with YopE,
00:26:54.21 and that's that there is an extreme gradient of expression
00:26:56.22 of the hmp gene.
00:26:58.15 On the edges, what we see.
00:27:00.08 and bacteria that are migrating into tissues.
00:27:03.10 the bacteria are all red, so they have high HMP expression.
00:27:08.07 However, in the center
00:27:10.21 you see the beginning of a gradient.
00:27:12.24 You see yellow,
00:27:14.19 which means that the red is expressed
00:27:16.23 at lower levels in these cells.
00:27:18.28 And in the center, frankly, you see green,
00:27:20.23 which means we see the green fluorescent protein
00:27:22.26 but we don't see the red fluorescent protein
00:27:26.09 in the center of these colonies.
00:27:28.12 Clearly, as the bugs migrate into tissues,
00:27:30.05 they're able to see nitric oxide.
00:27:32.11 This could also be displayed another way,
00:27:34.01 where we ratio the Cherry to the GFP
00:27:36.28 in this ratiometric display.
00:27:39.12 Red means that you have very high Cherry levels
00:27:41.28 blue means that the levels of GFP relative to Cherry
00:27:45.02 are very high.
00:27:46.16 This is over a 10-fold gradient
00:27:49.29 based on this ratiometric assay,
00:27:52.02 in which we can see that there's very low expressions of HMP
00:27:54.08 in the center of the colony
00:27:56.11 and very high on the edges.
00:27:58.02 This can also be displayed in another way,
00:28:00.28 in which we do 3-D imaging of this particular structure.
00:28:04.07 Okay, so.
00:28:05.26 now, the question is,
00:28:07.19 why is there this steep gradient?
00:28:10.02 And there's two explanations for why the gradient
00:28:12.09 could be steep.
00:28:13.29 One reason is that there's this gradient of expression,
00:28:16.21 where the bugs go from red to yellow to green
00:28:20.05 because the NO gradient in host tissues
00:28:22.26 is very steep.
00:28:24.10 As a result, the bacteria growing within the center of the colony
00:28:27.04 don't see NO.
00:28:29.02 But what we were more curious about
00:28:32.26 is whether we could find an example of community behavior.
00:28:35.04 That is, are the bacteria on the edges
00:28:37.09 facilitating growth of bacteria in the center
00:28:39.10 because they're removing nitric oxide from the center of the colony.
00:28:44.09 as displayed here.
00:28:46.27 Bacteria growing near a neutrophil
00:28:49.07 make the HMP protein.
00:28:51.18 They then remove or reduce the amount of NO
00:28:56.08 in the environment.
00:28:58.07 Blue is high NO
00:29:00.06 white or light blue is low NO.
00:29:02.10 Then as the NO gets lower,
00:29:04.11 then there's no NO in the system
00:29:05.29 where the bacteria are growing,
00:29:07.19 and then you no longer see hmp::Cherry on anymore,
00:29:11.01 and the bacteria are growing relatively free of NO
00:29:13.25 because of this community behavior.
00:29:16.00 So, how do we actually test this and
00:29:17.29 distinguish between these two models?
00:29:21.28 So, the way we distinguish between these two models
00:29:23.24 is we take advantage of the fact that
00:29:26.05 hmp actually inactivates NO,
00:29:28.03 so in a wild type organism,
00:29:30.27 the hmp will take NO
00:29:33.20 and reduce the amount of NO in the environment.
00:29:37.10 And in the wild type what will happen,
00:29:39.08 if there's a steep NO gradient.
00:29:41.07 we see a steep NO gradient with the wild type
00:29:43.09 because the gradient is simply steep,
00:29:46.03 and if you have an hmp- mutant
00:29:48.25 it doesn't matter whether it's inactivating the NO or not.
00:29:51.10 There's simply a steep gradient
00:29:53.04 from the presence of neutrophils making it high near them,
00:29:56.03 and then there's loss of NO
00:29:58.13 deeper into the colony.
00:30:00.15 On the other hand, if there's community behavior
00:30:03.23 you'll see a different result.
00:30:05.12 In the wild type, what happens is
00:30:07.29 the HMP protein would be removing the NO
00:30:10.18 from the environment
00:30:12.14 and then allowing bugs to grow
00:30:14.09 in the absence of hmp expression.
00:30:16.03 And then in the case of the mutant,
00:30:19.04 the hmp is no longer removing
00:30:22.01 NO from the tissues,
00:30:23.27 and now what happens is what we see.
00:30:26.10 is that the bacteria now are able to
00:30:29.17 induce the hmp expression because NO is not removed.
00:30:32.23 Alright, so this is a very simple experiment,
00:30:34.15 and we get a relatively simple answer.
00:30:38.21 The answer is the following.
00:30:40.29 that the gradient that we see is now gone.
00:30:43.12 So now, in this experiment what we do is
00:30:45.16 we've inverted the GFP.
00:30:47.09 what we've done here is we've taken the hmp- and the hmp+,
00:30:51.14 and what you see is the hmp+.
00:30:53.29 you see Cherry expression on the edges,
00:30:57.05 and then in the center
00:30:59.14 there's little expression at all.
00:31:01.06 So we've seen this before.
00:31:02.24 Now what happens, in the case of.
00:31:04.24 if we have an hmp- mutant,
00:31:06.13 this gradient is gone and we start, now,
00:31:08.00 to see Cherry now expressed at high levels
00:31:10.15 in the center of these colonies.
00:31:12.17 This can be seen in this 3-D reconstruction.
00:31:15.01 So right here,
00:31:17.18 the way we've displayed this data is,
00:31:19.19 if you have high fluorescence,
00:31:21.13 in the X axis you see high peaks,
00:31:23.16 and if you have low levels of expression
00:31:25.17 you see absence of peaks.
00:31:27.16 What you can see is, in the wild type situation,
00:31:29.26 there's a loss of expression in the center,
00:31:32.01 but in the deletion, where we're allowing
00:31:34.01 NO to get into the center of the colony,
00:31:35.25 we're seeing expression throughout the colony.
00:31:37.25 So we view this as community behavior.
00:31:41.17 Alright, now the question is this.
00:31:44.06 so, one of the most interesting aspects of this
00:31:46.27 is the fact that the bacteria on the edges of the colony
00:31:51.00 are facilitating the bacteria in the center to grow,
00:31:54.14 so that you actually need that expression on the outside
00:31:56.20 in order to cause disease,
00:31:58.19 and that can be seen here.
00:32:00.02 I showed you pictures of animals
00:32:02.03 in which we've sectioned through the spleen
00:32:04.12 3 days after infection,
00:32:06.14 and the size of the colonies
00:32:08.01 in either the wild type or the Δhmp mutant
00:32:10.08 look almost identical.
00:32:12.04 However, if you wait 5 days after infection,
00:32:14.02 what happens is the colonies continue to grow
00:32:16.23 in the wild type situation,
00:32:18.17 but in the mutant the colonies start to break apart.
00:32:21.20 What we find interesting about this
00:32:23.20 is that the ability to establish this colony
00:32:25.24 and maintain the colony is dependent on only a subset of bacteria
00:32:29.22 expressing this gene,
00:32:31.12 because these bacteria in the center aren't expressing it.
00:32:33.19 So, if the bugs on the outside
00:32:35.11 are unable to express this particular protein,
00:32:37.19 then what happens is the whole colony breaks apart.
00:32:43.12 Alright, now. so, the question is,
00:32:46.20 are we actually seeing two signals?
00:32:48.26 Is there a signal that's coming direct from the cell?
00:32:51.29 Or is there actually a soluble signal
00:32:53.26 and a signal that's coming from the host cell?
00:32:56.06 So, we look at that as either cell contact and NO
00:32:59.14 as a single signal that might be coming in
00:33:02.05 and the bugs on the edges are responding to,
00:33:04.16 whereas the bugs in the center
00:33:06.15 are responding to no signal at all,
00:33:08.27 and they're growing.
00:33:11.14 something in between a pathogen and non-pathogen.
00:33:14.15 Now, the alternative is that
00:33:16.08 there's actually three signals going on,
00:33:18.10 and that there's a cell contact and an NO signal
00:33:20.04 going on at the edges because these cells
00:33:22.08 are seeing NO as well as cell contact,
00:33:24.26 but then there's other bugs
00:33:26.29 which are within this particular tissue site
00:33:29.19 which are seeing NO but they're not seeing the host cell,
00:33:33.22 and then perhaps there's a third population
00:33:35.11 which is seeing neither the host cell nor NO.
00:33:37.24 So the, we draw this, therefore,
00:33:39.19 as three populations
00:33:41.24 in which there's bacteria on the edges
00:33:43.24 directly contacting the host,
00:33:45.27 and then there's other bacteria
00:33:47.19 which are not directly contacting a host cell,
00:33:49.19 but they might be seeing NO,
00:33:51.18 and then the ones in the center,
00:33:54.06 they're seeing neither NO nor the host cells.
00:33:57.20 So now, to distinguish between these two models
00:34:00.19 we set up another reporter situation.
00:34:03.00 So, in this reporter situation
00:34:04.18 we have the cell contact signal reporter,
00:34:09.02 yopE, now in red,
00:34:12.05 and GFP now fused to hmp.
00:34:14.13 We put them both into
00:34:16.18 either a wild type or a Δhmp strain,
00:34:18.26 and then we ask whether
00:34:21.02 we see a gradient of expression like we'd seen before.
00:34:23.29 If these two proteins. these two genes
00:34:27.01 are now responding to the identical signals,
00:34:29.20 the gradient that we see,
00:34:31.23 that gets removed when we're studying the hmp gene,
00:34:33.28 should also be removed
00:34:36.03 when we look at expression of yopE.
00:34:38.16 However, that's not what we see.
00:34:43.05 What you see is that.
00:34:44.25 now, the green GFP is HMP,
00:34:47.13 and what you see is there's HMP expression
00:34:49.10 throughout the colony,
00:34:51.13 but YopE is still expressed
00:34:53.15 at very high levels around the edges,
00:34:55.14 where it's in contact with host cells.
00:34:57.14 So, these two proteins are responding, therefore,
00:34:59.11 to different signals.
00:35:01.03 On the wild type, again, you see something similar
00:35:03.02 to what we've seen before.
00:35:04.20 You see this extreme gradient of expression of hmp.
00:35:12.11 Alright, so now we believe
00:35:14.00 that we've got three different signals.
00:35:15.23 There's ones that are missing both the cell contact signal
00:35:18.11 and the NO signal.
00:35:19.26 It doesn't mean they're not seeing some other signals
00:35:21.14 we haven't identified and, in fact,
00:35:24.03 my lab is trying to identify some other signals
00:35:25.24 that these ones in the center might be seeing
00:35:27.11 that might distinguish these cells
00:35:29.06 from organisms that are growing simply in culture.
00:35:31.24 There's ones that are responding to an NO signal.
00:35:34.03 They're not in contact with a host cell,
00:35:36.01 but they're turning on their high GFP levels.
00:35:38.21 And then the ones that are high GFP levels
00:35:40.19 that are on the edges
00:35:42.09 are responding to both the cell contact signal
00:35:44.00 and to an NO signal.
00:35:46.29 So now, the question is,
00:35:48.07 where is the nitric oxide coming from?
00:35:50.27 So, it could be coming directly from the host cells
00:35:53.17 which the organism is interacting with,
00:35:56.17 or it could be coming from somewhere else,
00:35:58.26 and the most straightforward way
00:36:00.22 to find out where the NO is coming from
00:36:02.24 is to study inducible nitric oxide synthase,
00:36:05.14 the protein which makes nitric oxide.
00:36:08.18 And so, we can determine
00:36:10.13 where the nitric oxide is coming from
00:36:13.01 by simply probing with antibody directly against
00:36:14.25 inducible nitric oxide synthase
00:36:16.26 and identifying cells
00:36:18.29 which are expressing this protein in tissues.
00:36:23.04 So what I'm going to show you
00:36:24.25 is a series of panels
00:36:26.24 in which I show you a typical colony
00:36:28.10 of Yersinia pseudotuberculosis growing in tissues.
00:36:30.23 In blue are the bacteria,
00:36:32.09 which we stain with antibody directed against the bacteria,
00:36:35.15 and you see this nice colony.
00:36:37.20 And then the second thing I'm going to show you
00:36:39.26 is a stain, now, for inducible nitric oxide synthase.
00:36:43.26 And surprisingly, what you see
00:36:46.05 is that although bacteria are growing within this colony here,
00:36:48.22 there's a gap,
00:36:50.09 and as I'll show you on the next side,
00:36:52.01 this gap actually has cells.
00:36:53.29 This gap where the cells
00:36:55.28 are not making inducible nitric oxide synthase.
00:36:58.09 Instead, the inducible nitric oxide synthase
00:37:00.15 is coming from cells in the periphery.
00:37:03.02 These cells out here
00:37:05.06 that are making inducible nitric oxide synthase,
00:37:07.03 we believe are macrophages and lymphocytes.
00:37:09.29 Now, if we stain with neutrophils,
00:37:11.22 which I've incessantly told you
00:37:14.16 the bugs are interacting with,
00:37:16.06 without actually giving you any evidence for,
00:37:18.13 what we find is that the neutrophils
00:37:20.14 are directly interacting with the bacteria,
00:37:23.03 but the neutrophils that are interacting with the bacteria
00:37:25.27 are, indeed, not making nitric oxide synthase.
00:37:28.16 So, the nitric oxide synthase is coming from afar,
00:37:31.19 and then managing to migrate through the neutrophils
00:37:35.11 and actually attacking the bacteria on the edges.
00:37:39.29 Okay, so this sort of summarizes
00:37:42.11 what I'd like to communicate with you today,
00:37:45.21 and that is that the nitric oxide-producing cells
00:37:48.19 are very far away,
00:37:50.25 and the nitric oxide producing cells
00:37:52.17 are not directly in contact with the [bacterial] cells,
00:37:54.26 but the bacteria are still responding to the nitric oxide.
00:37:58.17 When they respond to nitric oxide
00:38:00.20 , the nitric oxide gradient, which is displayed here
00:38:03.25 as blue:high to yellow:low,
00:38:06.14 when the bacteria encounter it,
00:38:08.14 the HMP protein inactivates it,
00:38:10.16 allowing bacteria in the center of the colony
00:38:12.11 to be naive for nitric oxide,
00:38:14.08 and not see it.
00:38:15.21 Furthermore, the bacteria in the center
00:38:17.12 are also protected from phagocytes,
00:38:19.18 because the ones on the edges
00:38:21.20 are acting to interfere with phagocytosis
00:38:23.20 and prevent their access
00:38:26.10 to the bacteria in the center of the colony.
00:38:29.07 Alright, so now,
00:38:31.07 why do we think this is important?
00:38:33.02 Do you think that this is a general model
00:38:34.24 for how all pathogens work?
00:38:36.20 And so, our way of thinking about this
00:38:38.21 is colored by work
00:38:41.03 that was published last year in Nature
00:38:44.00 by Hardt and Ackermann and coworkers,
00:38:46.26 who demonstrated, that in the case of Salmonella,
00:38:50.05 that if bacteria are.
00:38:52.18 in bacteria which are inoculated into an animal,
00:38:55.05 in this case a mouse,
00:38:56.26 and in this case it's Salmonella,
00:38:58.18 bacteria will make a virulence-dependent cascade,
00:39:03.17 which will allow them to invade into host tissues
00:39:07.02 and bypass the immune response.
00:39:10.16 What they demonstrated is that
00:39:12.29 all the bacteria in the population
00:39:14.28 actually express genes associated with virulence.
00:39:17.10 What they saw is that,
00:39:19.01 if you model this,
00:39:20.18 that the number of bacteria that are fully virulent
00:39:23.18 will decrease over time,
00:39:25.10 and instead they'll be replaced
00:39:27.04 by avirulent derivatives of the organism.
00:39:29.23 So, by having a virulence cascade
00:39:33.09 which is on in all the organisms in a tissue,
00:39:35.28 you actually select, now,
00:39:38.05 for faster growing, non-pathogenic variants,
00:39:40.20 which will overgrow the population.
00:39:42.29 On the other hand, if you build a pathogen
00:39:44.15 a little more wisely,
00:39:46.10 so that a proportion of the organisms
00:39:49.22 are not producing virulence-associated proteins,
00:39:53.08 then you see higher persistence
00:39:55.01 of the fully virulent organism.
00:39:57.05 So, what we believe is that
00:39:59.25 the reason why pathogens have this heterogeneous population
00:40:02.21 is that it's able to now allow
00:40:05.23 expression of proteins on the edges
00:40:08.06 which result in the organisms actually growing slower,
00:40:11.09 but dealing directly with the host immune function,
00:40:14.23 and then there's another population protected.
00:40:17.03 And this faster growing population,
00:40:18.23 which doesn't have to directly interact with host cells,
00:40:23.01 can outcompete avirulent derivatives,
00:40:25.11 because they're able to grow
00:40:27.14 just as fast as some avirulent derivative.
00:40:29.23 So, the fitness cost that an organism might have
00:40:32.20 from making virulence-associated proteins
00:40:35.06 is partially overcome
00:40:37.09 from the ability of these organisms to grow heterogeneously
00:40:39.18 in tissues.
00:40:42.08 So, let me summarize now,
00:40:44.20 with the three points that I want to make.
00:40:46.27 is that pathogen-specific proteins are only expressed
00:40:49.00 by a fraction of bacteria,
00:40:50.23 and we believe the reason for that
00:40:52.24 is because this allows them to
00:40:56.16 have a fitness cost which is less than they would have
00:40:58.24 if all the bacteria in the population
00:41:01.01 actually expressed virulence-associated proteins.
00:41:06.16 The environment in which the bacteria encounter
00:41:10.01 is different in different sites within the tissue,
00:41:13.09 and that includes in the narrow environment
00:41:15.17 in which the organism is growing.
00:41:17.18 And then finally,
00:41:20.03 as the bugs move into other sites,
00:41:22.05 there are different environments
00:41:24.07 which the microorganism encounters,
00:41:26.18 and when it encounters these different sites,
00:41:28.11 it encounters.
00:41:30.04 it will now respond with a different transcriptional profile.
00:41:34.26 So finally, I'd like to thank the people
00:41:37.15 who worked on this.
00:41:39.12 Sina Mohammadi was a graduate student
00:41:41.09 and a postdoc in my lab,
00:41:42.21 who did the initial reporters
00:41:44.06 to allow following of gene expression in tissues.
00:41:47.13 And of course, I'd like to thank Penelope Barnes,
00:41:49.14 who was an MD fellow in my lab,
00:41:51.09 who got us thinking about colonies within tissues.
00:41:54.15 And Molly Bergman and Greg Crimmins
00:41:57.04 did the initial studies which led to
00:41:59.18 most of this work which I've described,
00:42:01.09 which was performed by Kim Davis in my lab.
00:42:03.04 I've acknowledged her work throughout, on the slides,
00:42:05.04 with her name there.
00:42:07.12 And in addition, I'd like to thank Kerri Sheahan,
00:42:10.07 who's developed analysis of Type III translocation in my lab,
00:42:13.07 as well as special thanks to Joan Mecsas,
00:42:15.19 who is a far more expert
00:42:18.05 at animal infection models than I am,
00:42:20.04 and much of what I've learned has been learned from her.
00:42:22.24 And then my funding is from NIAID,
00:42:25.11 which has funded my lab on Yersinia
00:42:27.21 for over 20 years,
00:42:30.09 as well as Howard Hughes Medical Institute.
00:42:32.16 Thank you.

  • />Part 1: What Distinguishes a Pathogen from a Non-Pathogen?


Смотреть видео: Биология. Подготовка к олимпиаде 2017. Задача Производные эпидермиса (December 2022).