Информация

Разрушает ли этанол РНКазу?

Разрушает ли этанол РНКазу?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я получил противоречивый совет по этому поводу: некоторые люди считают, что можно удалить загрязнение РНКазой, просто опрыскивая стол, пипетки, перчатки и т. Д. Этанолом. Другие считают, что этанол не разрушает РНКазу, и для предотвращения загрязнения РНКаз необходимы специальные реагенты.

Так удаляет ли этанол загрязнение РНКазой? Если нет, то какой реагент?


Я думаю, что протоколы по очистке стеклянной посуды не рискуют и просто заботятся о деградации РНК, а не нацелены на один класс ферментов.

Предполагается, что EtOH денатурирует РНКазу и любые другие белки на поверхности.

Другие химические вещества, такие как диэтилпирокарбонат (DEPC), используемые для мытья посуды, убивают всю биохимическую активность, реагируя с нуклеофильными фрагментами в белке (-OH, -SH -NH (2/3)). (Подробнее см. Комментарии ниже.)

За этими процедурами следует нагревание при 300-450 F в течение 2-4 часов. Это не обеззараживание специфической РНКазой - вся биологическая активность уничтожается.

Активность РНКазы не оценивается путем специфического обнаружения конкретного фермента, а скорее оценивается по разложению образца РНК в лабораторных условиях. Так что специфическое ингибирование не имеет смысла - любой белок, который может взаимодействовать с РНК и разрушать ее, в этих протоколах называется РНКазой.


Вы не хотите только ингибировать или временно денатурировать РНКазы, если вы работаете с РНК, вы должны навсегда деактивировать РНКазы. Я работаю с РНК, и я не видел, чтобы кто-нибудь использовал этанол для удаления РНКаз, я бы не поверил, что он работает надежно. РНКазы - действительно стабильные ферменты, они даже частично выдерживают автоклавирование, поэтому я не удивлюсь, если они могут образоваться повторно после воздействия этанола.

Обычные методы удаления РНКаз:

  • Обработка 0,1% DEPC (нагреть как минимум до 60 ° C или автоклавировать, если возможно, чтобы удалить остатки DEPC позже). Не может использоваться, например, с Трис-буфер или что-нибудь еще, что с ним реагирует. DEPC является канцерогенным веществом, поэтому вы должны соблюдать соответствующие меры безопасности.
  • Все, что сделано из металла или стекла, нагрейте до 250 ° C в течение примерно 2 часов.
  • 1M NaOH не менее 30 минут (необходимо тщательно промыть, чтобы удалить NaOH)

Вы должны знать, что все, что разрушает РНКазы, скорее всего, сделает то же самое с вашей РНК.

Автоклавирование не защищает полностью от РНКаз, но все же значительно снижает активность РНКаз. Таким образом, хотя вы не должны полагаться на автоклавирование для избавления от РНКаз, по моему опыту, этого достаточно, если вы начнете с источника, который вряд ли будет содержать много РНКаз. Наконечники для пипеток (не вынимать наконечники из пакета, чтобы свести к минимуму манипуляции с ними) и фильтрованная через миллипор воду вода после автоклавирования довольно безопасны.

Существуют также коммерческие ингибиторы РНКазы, но я использовал их только в тех случаях, когда мне приходилось смешивать РНК и белок, а белок не был полностью свободен от РНКазы.


RNase и DEPC: развеивая мифы

DEPC. ЕСЛИ вы работаете с РНК, вы все это знаете. Это жизненно важно для избавления от растворов РНКаз, которые в противном случае разрушили бы ваши образцы или зонды. Но насколько хорошо вы это знаете?

Важный способ обучения методам, особенно когда вы начинаете карьеру в лаборатории, - из уст в уста более старшего коллеги. Обратной стороной этого подхода является то, что мудрость, передаваемая из поколения в поколение, часто воспринимается как истина: с оригинальной литературой не обращаются, а иногда вообще нет литературы, только ноу-хау.

Отсутствие ссылки на оригинальные концепции, несомненно, приводит к возникновению мифов, из которых с годами растут руки и ноги. Техники РНК особенно подвержены этому, потому что, работая с такими тонкими молекулами, люди склонны добавлять в свои протоколы немного больше подпитываемых паранойей настроек / ритуалов / чар вуду.

Одна из вещей, которые мы любим делать здесь, на Bitesize Bio, - это развеять эти мифы и предоставить нашим читателям факты о наиболее часто используемых методах. Мы и раньше говорили о работе с РНКазами (здесь и здесь), но ребята из Ambion также публикуют большое количество документации по фактам и советам по работе с РНК.

Одна из них - действительно хорошая статья о правде и мифах, лежащих в основе лечения DEPC от заражения РНКазой. В нем они проверяют и сообщают о 6 распространенных убеждениях о лечении DEPC и # 8230 здесь & # 8217сводка того, что они обнаружили:

НЕПРАВИЛЬНО: РНКазы регенерируют после денатурации в автоклаве, поэтому автоклавирование не подходит для обеззараживания РНКаз.

Тесты на РНКазу А до и после автоклавирования показали, что большая часть ее активности была уничтожена автоклавированием, поэтому, возможно, РНКазы не так уж непобедимы. Тем не менее, некоторая активность РНКаз осталась, поэтому, хотя они и не являются непобедимыми, РНКазы, безусловно, выносливы.

ИСТИНА: автоклавирование деактивирует DEPC

Что ж, слава богу, # 8211 DEPC действительно деактивируется автоклавированием. Механизм - гидролиз DEPC с образованием этанола и воды. Растворы 0,1% DEPC / вода должны быть полностью свободными от DEPC после автоклавирования в течение 15 минут / литр.

НЕВЕРНО: после автоклавирования растворы DEPC не должны иметь запаха.
Раствор будет по-прежнему пахнуть этанолом, а также иметь сладкий запах летучих сложных эфиров, образовавшихся в результате реакции этанола со следами карбоновых кислот.

ВЕРНО: Трис-содержащие растворы нельзя обрабатывать DEPC.

Аминогруппа на трис взаимодействует с DEPC, что делает его неспособным выполнять свою работу по обеззараживанию раствора.

ЛОЖНЫЙ: 0,1% DEPC достаточно для ингибирования любого количества РНКазы в растворе.
DEPC не является каталитическим, поэтому количество DEPC, необходимое для полного удаления РНКазы, увеличивается с концентрацией РНКазы, как показал аккуратный эксперимент в отчете.

ВЕРНО: 1% DEPC лучше удаляет РНКазу, чем 0,1%

Это, безусловно, правда, но более высокие концентрации DEPC означают, что после автоклавирования, вероятно, останется больше побочных продуктов DEPC / DEPC, которые могут препятствовать последующим применениям. В отчете указано, что эффективность реакции транскрипции in vitro снижается с увеличением концентрации DEPC, используемой для обработки воды.


Очистка пипеток

Требования к очистке зависят от используемой пипетки и жидкости. Перед очисткой следует проверить химическую совместимость дозатора. При необходимости следует надевать защитную одежду, очки и одноразовые перчатки.

Таблица 1. Рекомендации по очистке ручных пипеток Thermo Scientific. См. Инструкции по использованию электронных дозаторов.

Жидкости из пипеткиРекомендации по очистке
Водные растворы и буферыОткройте пипетку, тщательно промойте загрязненные части дистиллированной водой и дайте высохнуть.
Кислоты и щелочиПри работе с кислотами или щелочами рекомендуется очищать конус наконечника и нижнюю часть эжектора наконечника дистиллированной водой. Очистите, как описано в разделе «Водные растворы и буферы».
Органические растворителиПогрузите загрязненные детали в раствор моющего средства, например Deconex® 12 Basic. Тщательно промойте дистиллированной водой и дайте высохнуть.
Радиоактивные растворыОткройте пипетку и поместите загрязненные части в сильнодействующее моющее средство или чистящий раствор. Несколько раз промойте дистиллированной водой и дайте высохнуть.

  • ДНК можно удалить, погрузив части пипетки как минимум в 3% (мас. / Об.) Гипохлорита натрия на 15 минут (2,3). Хорошо промойте дистиллированной водой и дайте высохнуть.
  • Обработайте части пипетки дезинфицирующим средством для поверхностей Thermo Scientific DNA AWAY в соответствии с инструкциями.
  • Воздействие ультрафиолета в течение 30–60 минут еще больше снизит, но не полностью устранит загрязнение ДНК на поверхности пипетки (4).
  • Для удаления РНК не требуется специальной обработки, поскольку она быстро разлагается и чувствительна к повсеместным РНКазам.
  • РНКазу можно удалить, сначала очистив пипетку раствором моющего средства, а затем тщательно промыв водой, а затем 95% этанолом для ускорения процесса сушки. Затем части пипетки замачивают в 3% растворе перекиси водорода на 10 минут. Наконец, детали тщательно промывают водой, обработанной DEPC (5), и дают высохнуть.
  • Обработайте части пипетки дезинфицирующим средством для поверхностей Thermo Scientific RNase AWAY в соответствии с инструкциями.
  • ДНКазу можно разрушить автоклавированием (15 мин., 121 ° C / 250 ° F).

Перед сборкой пипетки протрите поршень 70% этанолом и смажьте смазкой, поставляемой с пипеткой. При удалении РНКазы используйте свежеоткрытый флакон с этанолом и приготовьте 70% этанол в воде, обработанной DEPC.


Десять источников загрязнения РНКазой

Жидкости организма, такие как пот, богаты активностью РНКаз (мы в шутку называем РНКазы из этих источников «фингеразами»). Таким образом, использование рук без перчаток могло легко привести к загрязнению РНКазой, ставя под угрозу критические эксперименты. Используйте перчатки и старайтесь выбрасывать использованные перчатки и часто надевать новую пару во время экспериментов.

Наконечники и трубки

Наконечники и пробирки могут быть источником загрязнения РНКазой, который легко не заметить. Простое автоклавирование не уничтожит всю активность РНКазы, поскольку эти ферменты очень устойчивы и могут восстановить частичную активность при охлаждении до комнатной температуры. Всегда используйте наконечники и пробирки, которые были протестированы и сертифицированы как свободные от РНКазы. Ambion предлагает широкий выбор сертифицированных насадок и пробирок, не содержащих РНКазы.

Вода и буферы

Из-за повсеместной природы РНКаз вода и буферы, используемые в приложениях молекулярной биологии, могут быть частыми источниками загрязнения РНКаз. DEPC-обработка - наиболее распространенный метод, используемый для инактивации РНКаз в воде и буферах. Однако некоторые реагенты, такие как Трис, нельзя обрабатывать DEPC. Ambion предоставляет различные буферы и воду (DEPC и не обработанную DEPC), которые гарантированно свободны от РНКазы. Также доступна альтернатива DEPC-обработке, RNAsecure, которая может использоваться для обработки растворов первичных аминов, таких как TRIS, и не требует 2-часовой обработки или автоклавирования.

Лабораторные поверхности

Контакт с лабораторными столами, стеклянной посудой, пластиковой посудой и другими поверхностями, подвергающимися воздействию окружающей среды, может привести к внесению загрязнения РНКазой в важнейшие эксперименты. Эти поверхности загрязняются из-за присутствия спор бактерий и грибов, присутствующих во многих лабораторных средах. Точно так же отмершие клетки кожи человека также могут привести к загрязнению открытых поверхностей. Эти поверхности можно обработать дезинфицирующим раствором РНКазы, таким как RNaseZap® от Ambion. Стеклянную и металлическую посуду можно запечь в течение ночи (достаточно от 6 до 8 часов) при 450 ° F, чтобы инактивировать РНКазы.

Эндогенные РНКазы

Все образцы тканей содержат эндогенные РНКазы. Вместо немедленной обработки жидкий азот часто используется для быстрого замораживания тканей после сбора урожая, чтобы минимизировать деградацию РНК. Однако замораживание ткани в жидком азоте не всегда удобно, особенно если необходимо сохранить большое количество образцов. Ambion's RNAlater ™ - это раствор для хранения и стабилизации тканей, который сохраняет РНК в тканях и клетках. Кусочки ткани можно просто бросить в 5-10 объемов RNAlater и хранить при 4 ° C в течение месяца до выделения РНК.

Образцы РНК

Небольшие количества РНКаз, которые могут очищаться совместно с изолированной РНК, могут поставить под угрозу последующие приложения. Такое загрязнение также может происходить из наконечников, пробирок и других реагентов, используемых в этих процедурах. Ингибиторы РНКазы обычно используются в качестве меры предосторожности при большинстве ферментативных манипуляций с РНК, чтобы контролировать такие загрязнения. SUPERase • In ™ Ambion - единственный ингибитор РНКазы, который ингибирует РНКазу A, T1 и РНКазу 1 (ингибитор плацентарной рибонуклеазы (RI) ингибирует только РНКазу A).

Плазмидные препараты

Плазмидная ДНК, используемая для транскрипции in vitro и сопряженной транскрипции: реакции трансляции могут вносить загрязнение РНКазой в реакции. Многие исследователи разрушают РНК в препаратах плазмид под действием РНКазы. Если эта процедура использовалась, Ambion рекомендует лечение протеиназой K с последующей экстракцией фенолом: хлороформом для удаления всех следов РНКазы до последующих реакций. Если матрица ДНК была линеаризована в результате расщепления рестрикционными ферментами, рекомендуется аналогичная обработка, поскольку рестрикционные ферменты могут быть загрязнены РНКазами.

Хранение РНК

Присутствие следовых количеств РНКазы может нарушить целостность РНК, даже если образцы хранятся замороженными в водной среде. Лучший способ сохранить изолированную РНК для длительного хранения - это осаждение солью / спиртом и хранение нуклеиновой кислоты в виде осадка в этом растворе. Низкая температура и присутствие алкоголя подавляют всю ферментативную активность. PH ниже нейтрального (из-за присутствия ацетата натрия или ацетата аммония) также помогает стабилизировать РНК. Обратите внимание, что РНК необходимо будет центрифугировать из этого раствора перед любым последующим применением. Другой вариант - ресуспендировать РНК в растворе для ресуспендирования Ambion RNAsecure ™, который содержит реагент, инактивирующий РНКазу. После добавления RNAsecure просто нагрейте образец при 60 ° C в течение 10 минут, чтобы инактивировать любые РНКазы. Если позднее возникнет подозрение на загрязнение образца, повторный нагрев деактивирует любые новые загрязнения.

Химические нуклеазы

Хотя загрязнение РНКазой чаще всего подозревают всякий раз, когда наблюдается деградация РНК, молекулы РНК также могут подвергаться разрыву цепи при нагревании в присутствии двухвалентных катионов, таких как Mg2 + или Ca2 +, при температуре> 80 ° C в течение 5 минут или более. Таким образом, хелатирующий агент должен присутствовать всякий раз, когда требуется нагревание РНК. Решение для хранения РНК было специально разработано для хранения РНК. Он содержит 1 мМ цитрата натрия, который является эффективным хелатором двухвалентных катионов, и имеет относительно низкий pH (

6.4), что минимизирует гидролиз оснований РНК.

Как коммерческие, так и полученные в лаборатории ферменты могут быть потенциальным источником загрязнения РНКазой. В Ambion мы использовали RNaseAlert (каталожный № 1964) для определения степени загрязнения РНКазой многих коммерчески доступных ферментов (для получения дополнительной информации прочтите «Не содержит ли ваша ДНКаза-РНКаза?». Важно, чтобы вы использовали только ферменты, которые не содержат РНКаз при работе с РНК.Ambion предоставляет ферменты, не содержащие РНКаз, для различных видов экспериментов по анализу РНК.


РНКазу следует добавлять, на каком этапе выделения гДНК с использованием фенолхлороформа m - после обработки лизоцимом / претеиназой k или после фенолхлороформа? (08 июня 2011 г.)

Интересно, хочу ли я получить чистую гДНК без загрязнения РНК, на каком этапе мне следует добавить РНКазу?

Протокол, который я использую:
- & # 62 Лечение лизоцимом в течение ночи
- & # 62 добавить SDS / протеиназу k + РНКазу и инкубировать при 37 ° C в течение 30 мин.
- & # 62 инкубировать при 56 0 C в течение 3 часов.
- & # 62 экстракция фенолом / хлороформом x 3
- & # 62 экстракция хлороформом
- & # 62 ацетат натрия + изопропанол

Я все еще получаю некоторое загрязнение рРНК при просмотре под гелем.
Интересно, что не так на моих этапах извлечения?
Кто-нибудь может дать совет?
Спасибо.

Как вы определили, что это геномная ДНК, не переваренная РНК?

Вы добавляете РНКазу на правильном этапе.

bob1 в Чт, 9 июня, 09:14:46 2011 сказано:

Как вы определили, что это геномная ДНК, не переваренная РНК?

Вы добавляете РНКазу на правильном этапе.

Прикрепленный файл представляет собой гелевую картинку с использованием лестницы ДНК размером 1 КБ.
удалось получить интактную полосу для гДНК, однако в нижней части геля есть мазок.
'href = "http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=3032" target = "_ blank">

ваш метод в порядке, может быть, вы сможете добавить больше РНКазы в следующий раз, это не повредит вашей концентрации гДНК. Я пробовал.

Вы также можете добавить RNse на последнем этапе после этапа Iso-p. Я имею в виду, что вы можете добавить РНКазу в воду, которую собираетесь добавить к гранулированной гДНК.

Я пробовал оба метода, но предпочитаю первый, потому что уверен, что моя гДНК чистая и ничто не мешает чтению Nanodrop.

В мазке гораздо больше шансов быть переваренной геномной ДНК. Для РНК вы, скорее всего, увидите полосы 18 и 28.

Curtis в четверг, 9 июня, 14:56:14 2011 сказал:

ваш метод в порядке, может быть, вы сможете добавить больше РНКазы в следующий раз, это не повредит вашей концентрации гДНК. Я пробовал.

Вы также можете добавить RNse на последнем этапе после этапа Iso-p. Я имею в виду, что вы можете добавить РНКазу в воду, которую собираетесь добавить к гранулированной гДНК.

Я пробовал оба метода, но предпочитаю первый, потому что уверен, что моя гДНК чистая и ничто не мешает чтению Nanodrop.

как избавиться от РНКазы, если она была добавлена ​​на последнем шаге?
когда мы добавляем sds & amp протеиназу k вместе с РНКазой и инкубируем при 37 o C, будет ли протеиназа k переваривать РНКазу, даже если температура не является оптимальной для протеиназы k? или SDS повлияет на активность РНКазы?

bob1 в Пт, 10 июня, 03:19:03 2011 сказано:

возможно ли деградировать рРНК? когда я измеряю OD и концентрацию, соотношение A260 / A280 не очень хорошее. в основном 1,5 или 2.
Я отправила изображение геля в службу технической поддержки одной из компаний по секвенированию, и она сказала, что гель показывает загрязнение рибосомной РНК.
она предлагает мне пройти лечение РНКазой и экстракцию фенолом хлороформом.
Сейчас я примеряю 2 образца и посмотрю, как получится.

Если вы собираетесь клонировать изолированную ДНК, то лучше удалить РНК из образца ДНК, но если вы работаете с анализом молекулярных маркеров, просто растворите паллету изолированной ДНК в буфере ТЕ, который уже содержит РНКазу (15 мкл 10 мг / мл РНКазы в 100 мл ТЕ. буфер). Вы получите хорошие результаты. Подскажите, над чем вы работаете.

123blockhead в четверг, 9 июня, 03:26:41 2011 сказал:

Интересно, хочу ли я получить чистую гДНК без загрязнения РНК, на каком этапе мне следует добавить РНКазу?

Протокол, который я использую:
- & # 62 Лечение лизоцимом в течение ночи
- & # 62 добавить SDS / протеиназу k + РНКазу и инкубировать при 37 ° C в течение 30 мин.
- & # 62 инкубировать при 56 0 C в течение 3 часов.
- & # 62 экстракция фенолом / хлороформом x 3
- & # 62 экстракция хлороформом
- & # 62 ацетат натрия + изопропанол

Я все еще получаю некоторое загрязнение рРНК при просмотре под гелем.
Интересно, что не так на моих этапах извлечения?
Кто-нибудь может дать совет?
Спасибо.

Vinod в Пт, 10 июня, 06:04:04 2011 сказал:

Если вы собираетесь клонировать изолированную ДНК, то лучше удалить РНК из образца ДНК, но если вы работаете с анализом молекулярных маркеров, просто растворите паллету изолированной ДНК в буфере ТЕ, который уже содержит РНКазу (15 мкл 10 мг / мл РНКазы в 100 мл ТЕ. буфер). Вы получите хорошие результаты. Подскажите, над чем вы работаете.

Я собираюсь отправить свои образцы гДНК для повторного секвенирования всего генома

1. Добавьте 2,5 мкл РНКазы к 0,5 мл неочищенного препарата ДНК (2,5 мкл РНКазы = 25 мкг РНКазы, поэтому обработка составляет 50 мкг / мл препарата ДНК).

2. Осторожно, но тщательно перемешайте и инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа.

3. Через 1 час добавьте смесь 0,3 - 0,4 мл хлороформа: изоамиловый спирт (24: 1) и тщательно перемешайте в течение 15 минут до образования эмульсии.

4. Центрифугировали эмульсию при 15000 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C.

5. Возьмите супернатант, избегая беловатого слоя на границе раздела.

6. Повторно осаждали ДНК добавлением двойного количества абсолютного спирта.


Содержание ДНК для анализа клеточного цикла фиксированных клеток с иодидом пропидия

В этом протоколе используется этанол для фиксации и повышения проницаемости клеток для окрашивания ДНК в интактных клетках йодидом пропидия (PI). Предоставляемые растворы для окрашивания PI являются разумной отправной точкой для определения концентраций флуорохрома, однако это будет зависеть от типа клеток и состояния клеток (доступности участков связывания ДНК).

Поскольку связывание флуорохрома не является ковалентным и обратимым, настоятельно рекомендуется установить оптимальную концентрацию для достижения равновесия для насыщения участков связывания ДНК ваших клеток. Вы достигли состояния насыщения, когда вы не видите никакого дополнительного увеличения среднего канала для вашей популяции G0 / G1, и вы достигли самого низкого возможного CV для вашей популяции G0 / G1 (в идеале <5%). Также критически важно поддерживать относительно постоянное соотношение краситель: клетки, особенно если вы планируете сравнивать гистограмму флуоресценции между образцами. Да, это означает, что вы должны каждый раз подсчитывать свои клетки перед окрашиванием ИП !! (Для более подробного объяснения того, почему это важно кликните сюда).

70% этанол
Окрашиваемые клетки
Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS)
Свежеприготовленный окрашивающий раствор йодида пропидия (PI) (см. Рецепт ниже)
Центрифужные пробирки 12X75 мм (желательно полипропиленовые)

Раствор для окрашивания PI (с Triton X-100 и РНКазой)

К 10 мл 0,1% (об. / Об.) Triton X-100 (Sigma) в PBS добавить 2 мг РНКазы A, не содержащей ДНКазы (Sigma) и 200 мкл 1 мг / мл PI ** (Sigma, BioSure, Molecular Probes и т. Д.) .). Готовьте свежее! Исходный раствор PI, полученный путем растворения 1 мг PI в 1 мл DH2O, можно хранить в течение нескольких месяцев при 0 & # 8211 4 ° C.
** - Эти концентрации являются рекомендуемой отправной точкой. Концентрации насыщения следует определять для конкретных типов / количества клеток.
Если РНКаза не свободна от ДНКазы, кипятите раствор 2 мг РНКазы А в 1 мл воды в течение 5 мин.


Простой и эффективный метод экстракции ДНК-полимеразы Taq

Термостабильная ДНК-полимераза (Taq Pol Ι) от Термус водный широко используется в ПЦР, которая обычно извлекается методом Pluthero®. В этом методе для осаждения фермента использовался сульфат аммония, и он экономил усилия и деньги, но не время. Более того, мы обнаружили, что 30-40% активности Taq Pol I теряется на стадии осаждения сульфатом аммония, а продукт содержит небольшое количество ДНК.

Полученные результаты

Мы предложили новый, упрощенный и недорогой метод очистки Taq Pol после перепроизводства фермента в кишечная палочка, который использовал этанол вместо сульфата аммония для осаждения фермента. Осадок можно непосредственно растворить в буфере для хранения без диализа. Кроме того, загрязнение ДНК и РНК было удалено с помощью ДНКазы I и РНКазы A перед преципитацией, и процедура экстракции была оптимизирована. Наши усовершенствования увеличивают скорость восстановления и удельную активность фермента, а также экономят труд, время и деньги.

Выводы

Наш метод использует этанол, ДНКазу I и РНКазу А для очистки Taq Pol, упрощает операцию и увеличивает скорость извлечения ферментов и качество.


Все три основных класса РНК, мРНК, тРНК и рРНК синтезируются путем транскрипции соответствующих генов и участвуют в синтезе белка.
1) мРНК передает сообщение от ДНК к рибосоме.
2) рРНК являются основными структурными компонентами рибосомы, синтезирующей белок.
3) тРНК действуют как адаптерные молекулы при выравнивании аминокислот в соответствии с последовательностью, присутствующей в мРНК.

РНК поддерживает гидроксильную группу во втором положении сахара рибозы, ДНК - нет.
Одна цепь дуплекса ДНК (матричная цепь) транскрибируется в сегмент показанной мРНК в соответствии с теми же правилами спаривания оснований, которые используются при репликации ДНК, за исключением того, что основание U используется в РНК вместо T.
Комплементарная цепь ДНК, последовательность которой по существу идентична последовательности мРНК, называется кодирующей цепью.

Транскрипция в эукариотах

РНК-полимераза движется вдоль матричной цепи ДНК в направлении от 3 простых до 5 простых, а молекула РНК растет в направлении от 5 простых до 3 простых.

Хотя транскрипция у эукариот аналогична транскрипции у прокариот, этот процесс кажется сложным.
Вместо одной РНК-полимеразы в эукариотической транскрипции участвуют три.
РНК-полимераза II продуцирует большинство мРНК и мяРНК.
РНК-полимераза II: типичный промотор для РНК-полимеразы II имеет короткую последовательность инициатора, состоящую в основном из пиримидинов и обычно ТАТА-бокса примерно на 25 оснований выше начальной точки.
Этот тип промотора (с ТАТА-боксом или без него) часто называют коровым промотором полимеразы II, потому что для большинства генов различные вышестоящие контрольные элементы также играют важную роль в инициации транскрипции.

Общие факторы транскрипции и полимераза подвергаются паттерну последовательного связывания, чтобы инициировать транскрипцию ядерных генов.
Сигналы терминации завершают транскрипцию РНК РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III без активности шпилечных структур, как это наблюдается у прокариот.
мРНК расщепляется на 10–35 пар оснований ниже последовательности AAUAAA (которая действует как сигнал добавления поли-A-хвоста).

Информационная РНК у эукариот сначала создается в виде гетерогенной ядерной мРНК (или пре-мРНК), а затем преобразуется в зрелую мРНК путем добавления структуры с 5 первичными кэпами, добавления поли-A-хвостов и сплайсинга интронов.
Для придания стабильности мРНК 5-прайм «кэп» (гуанозиновый нуклеотид, метилированный в 7-м положении) присоединяется к 1-му нуклеотиду в необычной связи «5 праймов с 5 праймами» (своего рода «в обратном направлении»).
В процессе кэппинга первые два нуклеотида сообщения также могут метилироваться.

Транскрипция эукариотических пре-мРНК часто происходит за пределами 3-прайм-конца зрелой мРНК.
Последовательность AAUAAA, расположенная немного выше правильного конца 3-прайма, затем сигнализирует о том, что цепь РНК должна быть расщеплена примерно на 10-35 нуклеотидов ниже сигнального сайта с последующим добавлением поли-A-хвоста, катализируемого поли (A) -полимеразой.

Сплайсосома представляет собой комплекс РНК-белок, который сплайсирует содержащую интрон пре-мРНК в ядре эукариот.

Большинство молекул мРНК имеют высокую скорость оборота, поскольку молекулы быстро разрушаются и заменяются, в то время как тРНК и рРНК относительно стабильны.
Период полураспада мРНК эукариот колеблется от минут до дней.
Транскрипция позволяет амплифицировать генетическую информацию, потому что может быть произведено множество копий мРНК, чтобы управлять синтезом большого количества белка.


Резюме: Как алкоголь влияет на мозг и поведение

Чрезмерное употребление алкоголя явно вредит нормальной работе мозга. Кратковременные эффекты включают интоксикацию и отравление алкоголем. Долгосрочные эффекты, показывающие, как употребление алкоголя влияет на мозг и поведение, включают ряд разрушительных изменений в физическом, психическом и поведенческом благополучии.

Некоторые из последствий хронического пьянства являются прямыми. Однако в список проблем также входят печеночная энцефалопатия, синдром Вернике-Корсакова и другие косвенные исходы. Подростки, которые пьют, имеют уникальные риски, связанные с мозгом, включая повышенные шансы развития алкоголизма. Улучшение возможно для людей, страдающих повреждением мозга, связанным с употреблением алкоголя. Однако, как правило, положительные результаты приходят только при воздержании от алкоголя.


Как концентрация этанола влияет на проницаемость клеточных мембран свеклы?

Неполярные растворенные вещества растворяются в неполярных растворителях, а липиды растворяются в алкоголь (спирт этиловый представляет собой органический растворитель, который может растворять неполярные и даже некоторые полярные вещества), таким образом, клетка мембрана будет нарушен, поскольку он растворен спирт этиловый решение. В мембрана также содержит холестерин.

Точно так же, как этанол разрушает клеточные мембраны? В клеточная мембрана содержит липиды (например, холестерин) и белки. Спирт этиловый из-за своих полярных и неполярных свойств может просачиваться через клеточная мембрана а также разрушать текучесть за счет денатурирования белков и воздействия на липиды (подобное в данном случае растворяется).

При этом, какое влияние температура оказывает на проницаемость клеточной мембраны свеклы?

Как вода температура увеличивает уровень впитываемости. Как сказано во введении, нагревая свекольная оболочка пигмент явно начинает вытекать, что делает его более проницаемый, белки начинают «денатурировать», и они больше не могут эффективно функционировать.

Как пигмент покидает клетки свеклы?

В клетка Мембрана (плазматическая мембрана) состоит в основном из бислоя фосфолипидных молекул с мозаикой белковых молекул, встроенных в нее и прикрепленных к ней. Красный пигмент из свекла сохраняется в клетки и выходит в окружающую среду только при повреждении мембраны.


Смотреть видео: Абсолютный спирт. Химия  Просто (February 2023).