Информация

Могут ли рибосомы читать оцДНК?

Могут ли рибосомы читать оцДНК?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мой вопрос заключается в том, можно ли осуществить перевод, естественным или искусственным путем, посредством считывания рибосомы (одноцепочечной) ДНК напрямую. Если нет, я хотел бы знать, что позволяет транслировать оцРНК, но не оцДНК.


Резюме

Информационные РНК, которые привлекаются к рибосоме для синтеза белка in vivo, должны удовлетворять конкретным структурным требованиям и должны взаимодействовать с факторами инициации белка, которые доставляют их к рибосоме. Родовая одноцепочечная ДНК (оцДНК) не обладает этими структурными характеристиками и поэтому не может транслироваться на рибосомах в естественных условиях.

Единственная описанная попытка транслировать аналоги этих мРНК на основе дезоксирибозы в условиях, эквивалентных условиям внутри клетки, оказалась безуспешной. Таким образом, хотя эксперименты предполагают, что оцДНК может быть способна связывать РНК-переносчик и обеспечивать синтез некоторого полипептида в нефизиологических условиях, это отражает только те аспекты биосинтеза белка, которые включают взаимодействия пар оснований между сообщением и другими РНК, участвующими в трансляции. Напротив, этапы, связанные с выбором первого инициирующего кодона и распознаванием терминирующих кодонов, включают взаимодействия между белковыми факторами и сообщением, где распознавание гидроксильной группы во 2ʹ-положении (и различение между тимином и урацилом) вполне может произойдет и предотвратит трансляцию синтетического сообщения оцДНК.

Если на самом деле не было выявлено дискриминации в отношении ДНК для компонентов рибосомной и транспортной РНК аппарата трансляции, это может быть связано с тем, что система возникла в «мире РНК» до того, как эволюционировала ДНК, и потому что свободная оцДНК в клетке образовалась. никогда не конкурировал с мРНК для рибосом, особенно после того, как возникли сложные системы на основе белков для выбора подходящего инициирующего кодона.

Современные физиологические взаимодействия мРНК с рибосомами

Трансляция мРНК рибосомами (биосинтез белка) - сложный процесс, который можно разделить на несколько стадий, каждая из которых обычно включает в себя различные РНК и белковые молекулы - факторы инициации (IF), факторы элонгации (EF) и факторы терминации или высвобождения. (РФ). Читателю, который не знаком с этим, рекомендуется прочитать отчет из учебника, например, в главе 29 книги Берга. и другие.. Однако, если кратко резюмировать, это: выбор правильного AUG (обычно) на мРНК для инициации, IF-зависимое связывание инициатор-тРНК с сайтом P, EF-зависимое и кодон-направленное связывание элонгатор-тРНК. образование пептидной связи, катализируемое большой рибосомной субъединицей, EF-зависимая транслокация и, в конечном итоге, направленное стоп-кодоном и RF-зависимое высвобождение завершенной полипептидной цепи.

Первый шаг имеет решающее значение для связывания естественных мРНК - предмета этого вопроса. В естественных клеточных условиях прокариоты и эукариоты используют разные методы обеспечения взаимодействия рибосомы с правильным кодоном мРНК для начала трансляции. У прокариот специфический сигнал связывания рибосомы (последовательность Шайна и Дальгарно) должен взаимодействовать с 16S рРНК, и на этом этапе участвует определенный белок фактора инициации. У эукариот основным методом является распознавание модифицированной структуры 5ʹ на мРНК и раскручивание вторичной структуры, также модулируемой факторами инициации белка.

Мне известно об одном сообщении о попытке трансляции основанного на ДНК аналога таких природных структур мРНК в любых условиях. Это был Дамиан и другие. (Biochim. Biophys. Res. Commun 385, 296-301 (2009)) и не увенчались успехом, хотя физические методы показали связывание с рибосомой. Я полагаю, что распознавание факторами инициации белка не происходило, но я не могу быть уверен, что спаривание оснований с 16S рРНК также было затруднено.

Тем не менее, можно ответить на поставленный вопрос:

Тот факт, что «случайной» одноцепочечной ДНК не хватало бы структурных особенностей для выбора правильного инициирующего кодона, объясняет, почему она не транслировалась. в естественных условиях - он не мог связываться с рибосомой.

Искусственные системы синтеза белка

Полные детали реакций на рибосоме появлялись только постепенно. Тем не менее, непонимание особенностей естественной мРНК, необходимой для связывания с рибосомой, не помешало ни разделению последующих стадий биосинтеза белка, ни использованию рибосомных систем для расшифровки генетического кода. Это связано с тем, что можно было обойти начальные этапы с помощью подходящих нефизиологических условий, которые позволяли полинуклеотидам или триплетам олигонуклеотидов связываться с рибосомой, где были возможны дальнейшие реакции, хотя, как правило, менее эффективно, чем в клетке. Такие условия включали высокие концентрации ионов магния и некоторых антибиотиков, влияющих на точность синтеза белка. Было высказано предположение, что нейтрализация заряда фосфатов основной цепи РНК с помощью Mg2+ усиливает (неспецифические гидрофобные взаимодействия в канале связывания мРНК и что антибиотики стабилизируют состояние рибосомы, в котором аминоацил тРНК может легче связываться (и, следовательно, способствовать связыванию полинуклеотидов путем спаривания оснований). кодоны связаны водородными связями с родственными антикодонами тРНК, последующие реакции удлинения зависели от компонентов рибосомы, отличных от искусственного мессенджера.

Таким образом, генетический код был расшифрован с использованием бактериальных бесклеточных систем, к которым были добавлены простые синтетические полинуклеотиды, лишенные последовательностей Шайна и Дальгарно или стартовых (или стоповых) кодонов; и экспериментами, в которых аминоацил-тРНК были связаны с триплетными кодонами в отсутствие как IF, так и EF. Другие частичные реакции синтеза белка были искусственно проанализированы аналогичным образом - реакция пептидилтрансферазы была изучена на изолированных 50S субъединицах с использованием только фрагмента тРНК и пуромицина путем проведения реакции в 50% этаноле!

Эксперименты с одноцепочечной ДНК

Понимая, что рибосомы можно заставить связывать и транслировать олиго-рибонуклеотиды, не являющиеся мРНК, в определенных искусственных условиях, мы можем рассмотреть значение сообщений о трансляции олиго-дезоксирибонуклеотидов - оцДНК.

Первоначальные эксперименты в этой области, проведенные Маккарти и Холландом в 1965 году, показали, что денатурированная ДНК из различных источников (включая клетки животных) может стимулировать включение радиоактивных аминокислот в бесклеточную систему бактерий, но это зависит от наличия антибиотиков. Кроме того, в лаборатории Хораны было показано, что активны только определенные синтетические полидезоксинуклеотиды (аналогичные поли-рибонуклеотидам, которые он использовал для расшифровки генетического кода). Таким образом, похоже, что в нефизиологических условиях, которые способствуют беспорядочному связыванию поли- и олиго-рибонуклеотидов, происходит некоторое связывание оцДНК и последующая трансляция.

В статье Рикера и Каджи, упомянутой @Mesentery, сообщается, что олигодезоксинуклеотиды могут действовать в некоторых частичных реакциях (связывание fmet-тРНК), но не в других. В частности, было невозможно провести RF-зависимую реакцию терминации с олигонуклеотидами, содержащими кодоны терминации, но - в присутствии антибиотиков - терминацию независимо от факторов высвобождения. делал происходить.

Таким образом, очевидно, что эти эксперименты, в которых оцДНК транслируется на рибосомы, не имеют физиологического значения. Однако все же уместно задать дополнение к вопросу о плакате, почему система вообще работает?

Почему дезоксирибоза (и тимин) нет подвергнуты дискриминации в искусственных условиях?

Ферменты синтеза и деградации нуклеиновых кислот - РНК и ДНК-полимеразы; рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы - специфичны либо для РНК, либо для ДНК (или в некоторых случаях для гибридов ДНК / РНК). Это важно как для обеспечения того, чтобы они выполняли свои специфические функции, так и, возможно, это неизбежное следствие характера их реакций - создание или разрыв сахарно-фосфатных связей. Здесь мы имеем дело с катализом белковым ферментом, который связывает эти структуры в своем активном центре.

Напротив, те реакции синтеза белка, для которых определенные требования могут быть ослаблены в нефизиологических условиях, включают: пары оснований взаимодействий. В современных рибосомах они могут быть оптимизированы ассоциированными белками, но считается, что последние появились позже. Искусственные условия, такие как высокие концентрации ионов магния или антибиотиков, можно рассматривать как разрешающие важные взаимодействия, которые существовали в «ур-рибосомах». И, конечно же, поскольку гибриды ДНК / РНК образуются легко, участие ДНК в таких взаимодействиях не так уж удивительно. (В мире РНК «ур-рибосом» - или даже в мире РНК / белков - не было бы необходимости дискриминировать ДНК, потому что она еще не возникла. А химически замена гидроксильной группы на водород могла не мешать взаимодействию - в худшем случае только ослабит его.)

Уместно, что современные реакции отбора и терминации AUG зависят от взаимодействия РНК-белок. Они вполне могут включать распознавание рибозы, а также последовательности оснований, что объясняет наблюдения Рикера и Каджи, а также Дамиана. и другие., упомянутый выше.


Мой вопрос заключается в том, можно ли осуществить перевод, естественным или искусственным путем, посредством считывания рибосомы (одноцепочечной) ДНК напрямую.

Рибосомы участвуют в трансляции мРНК в белки. См. Статью в Википедии для получения дополнительной информации

Если нет, я хотел бы знать, что позволяет транслировать оцРНК, а оцДНК - нет.

«Если нет» не имеет смысла, потому что ответ «да» или «нет» на первый вопрос не имеет ничего общего со вторым.

ssRNA и ssDNA относятся к генетическому материалу некоторых вирусов. В большинстве случаев я не думаю, что мы используем термины оцДНК и оцРНК для обозначения вируса, который осуществляет обратную транскрипцию РНК в ДНК, поэтому ваш вопрос неясен и сбивает с толку.

Некоторые вирусы действительно транскрибируют РНК в ДНК. Они делают это с помощью обратной транскриптазы.

В ответ на второй вопрос я хочу знать, какие структурные или химические характеристики позволяют считывать РНК, но не ДНК.

О, думаю, я понял ваш вопрос ...

Двухцепочечная ДНК точно не может транслироваться рибосомой. Я полагаю, что оцДНК может в конечном итоге вписаться в рибосому (или слегка модифицированную), однако тРНК следует адаптировать для использованияТи неU. Я не молекулярный биолог и не могу сказать большего.

Я хочу знать, как ДНК, лишенная 2-гидроксигруппы и использующая тимин вместо урацила, делает ее нечитаемой для рибосомы.

Я не знаю, есть ли, а если да, то не знаю почему! Извините, я ничем не могу больше помочь!


Классификация вирусов

Поскольку в вирусах отсутствуют рибосомы (и, следовательно, рРНК), они не могут быть классифицированы в рамках схемы трехдоменной классификации клеточных организмов. В качестве альтернативы доктор Дэвид Балтимор разработал схему классификации вирусов, которая фокусируется на взаимосвязи между вирусным геномом и тем, как он производит свою мРНК. В Балтиморская схема распознает семь классов вирусов.


Впервые в области клеточной биологии ученые наблюдают сборку рибосом в режиме реального времени.

Предоставлено: Исследовательский институт Скриппса.

Группа ученых из Scripps Research и Стэнфордского университета в реальном времени зафиксировала ключевой этап сборки рибосом - сложных и эволюционно древних «молекулярных машин», которые производят белки в клетках и необходимы для всех форм жизни.

Достижение, о котором сообщается в Клетка, раскрывает с беспрецедентной детальностью, как цепи рибонуклеиновой кислоты (РНК), клеточные молекулы, которые по своей природе липкие и склонны к неправильной укладке, «сопровождаются» рибосомными белками, правильно сворачиваясь и формируя один из основных компонентов рибосом.

Полученные данные опровергают давнее мнение о том, что рибосомы собираются в строго контролируемом пошаговом процессе.

«В отличие от того, что было доминирующей теорией в этой области, мы выявили гораздо более хаотический процесс», - говорит Джеймс Р. Уильямсон, доктор философии, профессор кафедры интегративной структурной и вычислительной биологии в Scripps Research. «Это не гладкая сборочная линия в Детройте - это больше похоже на торговую яму на Уолл-стрит».

Для исследования лаборатория Уильямсона сотрудничала с лабораторией Джозефа Пуглиси, доктора философии, профессора Стэнфордского университета. Несмотря на то, что эта работа является значительным достижением фундаментальной клеточной биологии, она должна способствовать важным достижениям в медицине. Например, некоторые современные антибиотики действуют путем ингибирования бактериальных рибосом. Новое исследование открывает возможность разработки будущих антибиотиков, которые нацелены на бактериальные рибосомы с большей специфичностью - и, следовательно, с меньшими побочными эффектами.

В более общем плане исследование предлагает биологам новый мощный подход к изучению молекул РНК, сотни тысяч из которых активны в любой момент времени в типичной клетке.

«Это показывает, что теперь мы можем подробно изучить, как складываются РНК, пока они синтезируются, а белки собираются на них», - говорит первый автор Оливье Дасс, доктор философии, научный сотрудник отдела интегративной структурной и вычислительной биологии. в Scripps Research. «Это было очень сложно изучать в биологии, потому что это включает в себя несколько различных биологических процессов, которые зависят друг от друга и должны быть обнаружены одновременно».

Команда использовала передовую технологию визуализации под названием «волноводная флуоресцентная микроскопия одиночных молекул с нулевым режимом», которую они адаптировали в последние годы для отслеживания РНК и белков в реальном времени. Рибосомы состоят как из РНК, так и из белков, что отражает молекулярное партнерство, которое, как широко считается, восходит к зарождению жизни на Земле.

В доказательном исследовании, опубликованном в прошлом году, исследователи использовали свой подход, чтобы зафиксировать раннюю, короткую и относительно хорошо изученную стадию сборки рибосом из бактерии E. coli. Это включало транскрипцию или копирование из соответствующего гена рибосомной РНК и начальные взаимодействия этой цепи РНК с рибосомным белком.

В новом исследовании команда расширила этот подход, отслеживая не только транскрипцию рибосомальной РНК, но и ее сворачивание в реальном времени. Работа позволила детально изучить сложную и до сих пор таинственную часть сборки рибосомы E. coli - формирование целого основного компонента или домена рибосомы E. coli с помощью восьми белковых партнеров, которые заканчиваются. вверх включены в структуру.

Ключевым открытием было то, что рибосомальные белки-партнеры направляют сворачивание цепи РНК через множественные временные взаимодействия с ней задолго до того, как они займут свои конечные места в свернутой молекуле РНК-белка. Полученные данные, по словам исследователей, также намекают на существование неизвестных факторов сборки РНК, скорее всего белков, которые не присутствовали в их экспериментах по визуализации в лабораторных чашках, но присутствуют в клетках и повышают эффективность сворачивания РНК.

«Наше исследование показывает, что при сворачивании рибосомной РНК и, возможно, в более общем плане при сворачивании РНК в клетках, многие белки помогают сворачивать РНК, несмотря на слабые, временные и полеспецифические взаимодействия с ней», - говорит Дасс.

Теперь команда сможет расширить это исследование, чтобы изучить не только остальную часть сборки рибосом, которая включает в себя несколько цепей РНК и десятки белков, но также и многие другие типы сворачивания РНК и взаимодействия РНК-белок в клетках.

В принципе, это исследование даст представление о том, как неправильно складываются РНК и как такие события можно исправить. Ученые считают, что многие заболевания связаны или потенциально связаны с неправильным сворачиванием и связанной с ним обработкой РНК в клетках.

Лечение, которое уже нацелено на рибосомы, также может быть улучшено. Некоторые современные антибиотики, в том числе класс, известный как аминогликозиды, действуют путем связывания с участками бактериальных рибосом, которых нет на рибосомах человека. Эти препараты могут иметь побочные эффекты, потому что они также повреждают рибосомы полезных бактерий, например, в кишечнике.

«Когда мы более полно поймем, как собираются и функционируют бактериальные рибосомы, мы потенциально можем нацелить их таким образом, чтобы воздействовать на более узкую группу вредных видов бактерий и уберечь хорошие, уменьшая побочные эффекты для пациентов», - говорит Дасс.

Поскольку рибосомы действуют как производители белка, они также имеют решающее значение для выживания быстрорастущих опухолевых клеток. Некоторые классы противораковых препаратов уже работают, тем или иным образом замедляя образование рибосом. «Лучшее понимание человеческой рибосомы, в принципе, позволит более точно нацелить ее сборку и эффективно блокировать рост рака», - отмечает Дасс.

Другим соавтором исследования «Руководство по переходным взаимодействиям белка и РНК в складывании формирующейся рибосомной РНК» была Галина Степанюк, кандидат наук, Scripps Research.


Предупреждение для биологов: рибосомы могут переводить «непереведенную область» матричной РНК

Исследователи из Джона Хопкинса заявляют, что, столкнувшись с неожиданным вызовом давно признанному факту биологии, они обнаружили, что рибосомы - молекулярные машины во всех клетках, которые строят белки, - иногда могут делать это даже в так называемых нетранслируемых областях ленты генетического материала, известные как информационная РНК (мРНК).

«Это захватывающая находка, которая порождает целый ряд новых вопросов для исследователей», - говорит Рэйчел Грин, доктор философии, исследователь из Медицинского института Говарда Хьюза и профессор молекулярной биологии и генетики Медицинского факультета Университета Джонса Хопкинса. Главный из них, добавляет она, - это то, обладают ли белки, полученные таким необычным способом, полезными или вредными функциями и при каких условиях - вопросы, которые могут помочь нам в понимании роста раковых клеток и того, как клетки реагируют на стресс.

Резюме результатов исследований дрожжевых клеток было опубликовано 13 августа в журнале Клетка, Грин и ее команда сообщают, что производство атипичного белка происходит, когда рибосомы не могут «переработаться», когда они достигают сигнала «стоп» в мРНК. По еще не понятным причинам, говорит Грин, «мошеннические» рибосомы перезапускаются без «стартового» сигнала и производят небольшие белки, функции которых неизвестны.

Рибосомы состоят из специализированных молекул РНК (химические родственники ДНК), которые работают вместе с белками, считывая несущие инструкции мРНК и «транслируя» их сообщение для создания белков. Каждая мРНК начинается с «стартового» кода, за которым следует план для конкретного белка, за которым следует «стоп-код». А еще есть сегмент кода, который всегда называли «непереведенной областью», потому что ученые никогда не видели, чтобы он был переведен в белок.

Но больше нет, по словам Грина и научного сотрудника Николаса Гайдоша, доктора философии, который вместе с командой из Национального института здоровья детей и развития человека начал проект из любопытства по поводу дрожжевого белка под названием Rli1.

Предыдущие исследования показали, что Rli1 может расщеплять рибосомы на две составляющие, когда они сталкиваются со стоп-кодом и больше не нужны. Они говорят, что этот процесс «рециркуляции» отделяет рибосому от ее текущей молекулы мРНК, чтобы она была доступна для трансляции другой. Но неясно, ведет ли себя Rli1 таким же образом в живых клетках.

Чтобы выяснить это, исследователи лишили живые дрожжевые клетки Rli1, предсказав, что трансляция будет замедляться, поскольку рибосомы накапливаются в стоп-кодах. Чтобы «увидеть», где находятся рибосомы, команда добавила к клеткам фермент, который пережевывает любую открытую РНК. РНК, связанная рибосомами, будет защищена, а затем может быть выделена и идентифицирована. Как и предполагалось, истощение Rli1 увеличивает количество рибосом, находящихся на стоп-кодах. Но они также увидели доказательства того, что рибосомы находятся в непереведенной области, что они назвали сюрпризом.

Чтобы выяснить, действительно ли рибосомы считывают данные из нетранслируемой области для создания белков, команда вставила в эту область генетический код для белка, количество которого они могли легко измерить. Клетки с Rli1 не производили белок, но клетки с отсутствующим Rli1 производили, что доказывает, что их рибосомы действительно были активны в нетранслируемой области.

Дальнейшие эксперименты показали, что рибосомы не просто продолжали трансляцию после стоп-кода, чтобы создать сверхдлинный белок. Сначала они как обычно высвободили регулярно кодируемый белок, а затем снова начали трансляцию поблизости.

«Кажется, что рибосомы устали ждать, пока их разберут, и решают вернуться к работе», - говорит Гайдош. «Работа по производству белка, которая появляется прямо перед ними, находится в непереведенной области».

Как уже отмечалось, назначение этих многих маленьких белков неизвестно, но Грин говорит, что одна возможность связана с тем фактом, что рибосомы увеличиваются в нетранслируемой области, когда дрожжи испытывают стресс из-за недостатка пищи. «Возможно, эти маленькие белки действительно помогают дрожжам реагировать на голод, но это лишь предположение», - говорит она.

Грин отмечает, что, поскольку рибосомы необходимы для создания новых белков и роста клеток, ученые считают, что скорость репликации клеток определяется, по крайней мере частично, тем, сколько в них рибосом. Клетки, лишенные Rli1, не могут расти, потому что все их рибосомы заняты в стоп-кодах и в нетранслируемых областях. Таким образом, раковые клетки повышают уровень Rli1 для быстрого роста.

«Ранее мы не понимали, насколько важна рециркуляция рибосом для правильной трансляции мРНК», - говорит Грин. «Без этого рибосомы отвлекаются от своей обычной работы, которая имеет решающее значение для нормального поддержания и роста клеток. Это открытие вызывает вопросы, которые мы даже не знали раньше ».

Среди других авторов отчета - Дэвид Янг, Фан Чжан и Алан Хиннебуш из Национального института здоровья детей и человеческого развития Юнис Кеннеди Шрайвер.

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом детского здоровья и развития человека и Медицинским институтом Говарда Хьюза.


ПЕРЕМЕЩЕНИЕ РИБОСОМ

Для достижения своих целей Бадран разработал так называемую систему «ортогональной трансляции», в которой клетка содержит как свой собственный рибосомный аппарат, так и вторичную синтезированную рибосому, которая может производить только один белок. Система позволяет ему возиться со вторичной рибосомой, не нарушая исходную и не убивая клетку. Это позволяет ему исследовать, как сначала развился рибосомный комплекс, что делают его различные компоненты и какие части необходимы для построения белков.

Бадран также использует направленную эволюцию для создания разновидностей рибосомных частей и передачи молекул РНК, которые работают с рибосомами, помогая строить белки. Он использует вторичную рибосому, чтобы проверить возможности новых частей, которые он строит, которые, как он надеется, помогут рибосоме научиться считывать четверные кодоны и создавать новые белки.

Подробнее

Молодая лаборатория Бадрана была занята. Они создали рибосомы, которые переводят мРНК в белки быстрее, чем их естественные аналоги, что может помочь в производстве биологических лекарств более эффективно. Они спроектировали Кишечная палочка для размещения пула рибосом из различных микроорганизмов, что может помочь ученым разработать лекарства, более избирательно нацеленные на определенные патогены. Они также продвигаются к системе квадруплетных кодонов, расшифровывая, какие четырехбуквенные кодоны каким аминокислотам будут соответствовать.

Бадран и его коллеги надеются, что их усилия по переосмыслению рибосомы помогут им узнать о происхождении этой древней молекулярной машины. «Я хочу создать методы, которые позволят нам понять существующие вещи, а затем разработать новые инструменты для их изучения и, возможно, даже исследовать самые пределы биологии», - сказал Бадран. «Открытие чего-то, что было вне досягаемости ученых, - вот что меня действительно волнует».


Новый инструмент редактирования генов может конкурировать с CRISPR и вносит миллионы правок за один раз

С стремительным ростом CRISPR как чудо редактирования генов легко забыть о его скромном происхождении: впервые он был обнаружен как причуда бактериальной иммунной системы.

Кажется, что бактерии могут предложить больше. В этом месяце команда под руководством известного синтетического биолога доктора Джорджа Черча из Гарвардского университета захватила еще один странный образец биологии бактерий. В результате получился мощный инструмент, который теоретически может одновременно редактировать миллионы последовательностей ДНК с помощью «штрих-кода» для отслеживания изменений. И все это без разрыва ни единой хрупкой нити ДНК.

На данный момент эти биологические инструменты, называемые «рекомбинирование ретронной библиотеки (RLR)», были протестированы только на бактериальных клетках. Но, как показывает путь CRISPR к генной терапии, даже самые странные открытия, сделанные низшими созданиями, могут катапультировать наши самые смелые мечты о генной терапии или синтетической биологии в реальность.

«Эта работа помогает составить дорожную карту к использованию RLR в других генетических системах, которая открывает много интересных возможностей для будущих генетических исследований», - сказал Черч.

Подождите, почему CRISPR неадекватен?

Ретроны странные. Вместо этого давайте начнем с CRISPR.

Возможно, вы уже знакомы с тем, как это работает. Есть два компонента: тип РНК и белок. Направляющая РНК «ищейки» связывает «ножничный» белок Cas с определенным геном. В классической версии Кас рубит ген, чтобы выключить его. Более поздние достижения позволяют Cas заменить конкретную генетическую букву или отрезать сразу несколько генов.

В случае с вариантом «рубить и заменять», когда ген исцеляет сам себя, он часто будет искать шаблон. CRISPR может нести матричный ген, на который может полагаться клетка. Таким образом, клетку вводят в модификацию генетической копии: заменяя дефектное генетическое предложение на биологически грамматическое.

Проблема с CRISPR - это разрезание ДНК. Если вы когда-либо сокращали предложение на своем телефоне, понимали, что вы сокращаете неправильные фрагменты, вставляете его обратно с другим сообщением, которое теперь не имеет смысла, и нажимаете отправить - что ж, это похоже на то, что может случиться с CRISPR. Опасность повреждения нашего генома возрастает, когда нам нужно редактировать несколько генов. Это становится огромной проблемой в синтетической биологии, которая использует генетические манипуляции для наделения клеток новыми способностями или даже для создания совершенно новых организмов.

Клетки - упрямые существа, появившиеся в течение эонов эволюции, поэтому изменения одного гена редко бывает достаточно, чтобы заставить, например, бактерии выкачивать биотопливо или лекарства, что делает необходимым редактирование мультиплексных генов. Большинство клеток также быстро делятся, поэтому важно, чтобы любые генетические изменения передавались из поколения в поколение. CRISPR часто борется с обоими. Команда Церкви думает, что у них есть решение.

Познакомьтесь с ретронами

Новый инструмент называется RLR, и первая буква «R» обозначает ретроны. Это широко распространенные, но совершенно загадочные существа, «естественная биология которых в значительной степени неизвестна», пишет команда. Хотя они похожи на CRISPR, они могут быть вовлечены в бактериальную иммунную систему.

Впервые обнаруженные в 1984 году, ретроны представляют собой плавающие ленты ДНК в клетках некоторых бактерий, которые могут быть преобразованы в особый тип ДНК - единую цепочку оснований ДНК, названную оцДНК (да, это странно). Но это фантастическая новость для редактирования генов, потому что двухцепочечные последовательности ДНК наших клеток при делении становятся впечатляющими одиночными цепями. Идеальное время для ретронной наживки.

Обычно наша ДНК существует в виде двойных спиралей, которые плотно скручены в 23 пучка, называемых хромосомами. Каждый пучок хромосом состоит из двух копий, и когда клетка делится, копии разделяются и дублируются. В течение этого времени две копии иногда меняют местами гены в процессе, называемом рекомбинацией. Это когда ретроны могут проникнуть внутрь, вместо этого вставляя свое потомство оцДНК в делящуюся клетку. Если они используют новые уловки - например, позволяют клетке бактерии стать устойчивой к лекарствам - и успешно внедряются, то потомство клетки унаследует эту черту.

Благодаря естественному механизму клетки ретроны могут проникать в геном, не разрезая его. И они могут делать это в миллионах делящихся клеток одновременно.

& # 8220Мы решили, что ретроны должны давать нам возможность производить оцДНК внутри клеток, которые мы хотим редактировать, а не пытаться заставить их проникнуть в клетку извне, и без повреждения нативной ДНК, что было очень убедительно. 8221 сказал автор исследования доктор Дэниел Гудман.

Создание РТР

Подобно CRISPR, RTR имеет несколько компонентов: генетический фрагмент, содержащий мутацию (приманка), и два белка, RT и SSAP (обратная транскриптаза и одноцепочечные белки отжига), которые трансформируют ретрон в оцДНК и позволяют ему вставлять себя в делящуюся клетку.

Как и в «Игре престолов», здесь много игроков. Итак, чтобы было понятнее: ретроны несут генетический код, который мы хотим вставить, RT превращает его в более совместимую форму, которая называется оцДНК, а SSAP вставляет его в ДНК по мере ее деления. По сути, троянский конь вторгается в клетку и извергает шпионов, которые внедряются в клетку, изменяя ее ДНК, с помощью ферментативных магов.

Эти два белка являются новинкой для нашей компании. Ранее ученые пытались использовать ретроны для редактирования генов, но эффективность была чрезвычайно низкой - около 0,1 процента всех инфицированных бактериальных клеток. Двое новичков успокоили естественную «сигнальную систему» ​​бактерий, которая исправляет изменения ДНК - поэтому они игнорируют новые части ДНК - и позволяют вносить изменения и передавать их следующему поколению. Еще одна уловка заключалась в том, чтобы стерилизовать два гена, которые кодируют белки, которые обычно разрушают оцДНК.

В одном из тестов команда обнаружила, что более 90 процентов бактериальных клеток легко допускают новую последовательность ретрона в свою ДНК. Затем они стали большими. По сравнению с CRISPR, ретроны имеют преимущество в том, что их последовательность может действовать как штрих-код. Это означает, что можно проводить несколько экспериментов по редактированию генов одновременно и выяснять, какие клетки редактировались с помощью какого ретрона, путем секвенирования штрих-кода.

В ходе проверки концепции команда взорвала некоторые бактериальные клетки ретронами, которые содержали последовательности для определения устойчивости к антибиотикам. Посредством секвенирования только ретронных букв ДНК из пула бактерий, обработанных антибиотиками, они обнаружили, что количество клеток с ретронами, дающих им новую сверхспособность против лекарств, осталось намного выше, чем у других клеток.

В другом тесте команда попыталась определить, сколько ретронов они могут использовать одновременно. Они взяли другой штамм бактерий, устойчивых к антибактериальным препаратам, и разрезали его геном, чтобы создать библиотеку из десятков миллионов ретронов. Затем они вставили эти фрагменты в обручи ДНК, называемые плазмидами, и поместили их в клетки бактерий. Как и прежде, команда могла легко найти ретроны, которые придали антибактериальную силу, путем секвенирования штрих-кодов оставшихся в живых.

Но почему?

Вот как. Но почему?

The goal is easy: to find another solution to CRISPR that can influence millions of cells at once, without damaging the cells. In other words, take gene editing into the big data era, through multiple generations.

Compared to CRISPR, the new RLR tool is simpler because it does not require a “guide” tool in addition to an “editing” tool—a retron is basically a two-in-one. Being able to influence multiple genes at once—without physically cutting into them—also makes it an intriguing tool for synthetic biology. The tool’s also got staying power. Instead of a “one and done” CRISPR ethos, it lasts through generations as cells divide.

That said, RTR’s got competition. Because it works best with dividing cells, it might not be as powerful in reluctant cells that refuse to split—for example, neurons. For another, recent upgrades to CRISPR have made it possible to also turn genes on or off—without cutting them—through epigenetics.

But RLR offers scale. “Being able to analyze pooled, barcoded mutant libraries with RLR enables millions of experiments to be performed simultaneously, allowing us to observe the effects of mutations across the genome, as well as how those mutations might interact with each other,” said Church.


СОДЕРЖАНИЕ

Ribosomes are the macromolecular machines that are responsible for mRNA translation into proteins. The eukaryotic ribosome, also called the 80S ribosome, is made up of two subunits – the large 60S subunit (which contains the 25S [in plants] or 28S [in mammals], 5.8S, and 5S rRNA and 46 ribosomal proteins) and a small 40S subunit (which contains the 18S rRNA and 33 ribosomal proteins). [6] The ribosomal proteins are encoded by ribosomal genes.

rRNA found in prokaryotic and eukaryotic ribosomes
Тип Размер Large subunit (LSU rRNA) Small subunit (SSU rRNA)
прокариотический 70S 50S (5S : 120 nt, 23S : 2906 nt) 30S (16S : 1542 nt)
эукариотический 80S 60S (5S : 121 nt, [7] 5.8S : 156 nt, [8] 28S : 5070 nt [9] ) 40S (18S : 1869 nt [10] )

There are 52 genes that encode the ribosomal proteins, and they can be found in 20 operons within prokaryotic DNA. Regulation of ribosome synthesis hinges on the regulation of the rRNA itself.

First, a reduction in aminoacyl-tRNA will cause the prokaryotic cell to respond by lowering transcription and translation. This occurs through a series of steps, beginning with stringent factors binding to ribosomes and catalyzing the reaction:
GTP + ATP --> pppGpp + AMP

The γ-phosphate is then removed and ppGpp will bind to and inhibit RNA polymerase. This binding causes a reduction in rRNA transcription. A reduced amount of rRNA means that ribosomal proteins (r-proteins) will be translated but will not have an rRNA to bind to. Instead, they will negatively feedback and bind to their собственный mRNA, repressing r-protein synthesis. Note that r-proteins preferentially bind to their complementary rRNA if it is present, rather than mRNA.

The ribosome operons also include the genes for RNA polymerase and elongation factors (used in RNA translation). Regulation of all of these genes at once illustrate the coupling between transcription and translation in prokaryotes.

Ribosomal protein synthesis in eukaryotes is a major metabolic activity. It occurs, like most protein synthesis, in the cytoplasm just outside the nucleus. Individual ribosomal proteins are synthesized and imported into the nucleus through nuclear pores. See nuclear import for more about the movement of the ribosomal proteins into the nucleus.

The DNA is transcribed, at a high speed, in the nucleolus, which contains all 45S rRNA genes. The only exception is the 5S rRNA which is transcribed outside the nucleolus. After transcription, the rRNAs associate with the ribosomal proteins, forming the two types of ribosomal subunits (large and small). These will later assemble in the cytosol to make a functioning ribosome. See nuclear export for more about the movement of the ribosomal subunits out of the nucleus. [11]

Processing Edit

Eukaryotic cells co-transcribe three of the mature rRNA species through a series of steps. The maturation process of the rRNAs and the process of recruiting the r-proteins happen in precursor ribosomal particles, sometimes called pre-ribosomes, and takes place in the nucleolus, nucleoplasm, and cytoplasm. The yeast, С. cerevisiae is the eukaryotic model organism for the study of ribosome biogenesis. Ribosome biogenesis starts in the ядрышко. There, the 18S, 5.8S, and 25S subunits of the rRNA are cotranscribed from ribosomal genes as a polycistronic transcript by RNA polymerase I, [3] and is called 35S pre-RNA. [1]

Transcription of polymerase I starts with a Pol I initiation complex that binds to the rDNA promoter. The formation of this complex requires the help of an upstream activating factor or UAF that associates with TATA-box binding protein and the core factor (CF). Together the two transcription factors allow the RNA pol I complex to bind with the polymerase I initiation factor, Rrn3. As the pol I transcript is produced, approximately 75 small nucleolar ribonucleoparticles (snoRNPs) facilitate the co-transcriptional covalent modifications of >100 rRNA residues. These snoRNPs control 2’-O-ribose methylation of nucleotides and also assist in the creation of pseudouridines. [1] At the 5’ end of rRNA transcripts, small subunit ribosomal proteins (Rps) and non-ribosomal factors assemble with the pre-RNA transcripts to create ball-like knobs. These knobs are the first pre-ribosomal particles in the small (40S) ribosomal subunit pathway. [1] The rRNA transcript is cleaved at the A2 site, and this separates the early 40S pre-ribosome from the remaining pre-rRNA that will combine with large subunit ribosomal proteins (Rpl) and other non-ribosomal factors to create the pre-60S ribosomal particles. [1]

40S subunit Edit

The transcriptional assembly of the 40S subunit precursor, sometimes referred to as the small subunit processome (SSU) or 90S particle happens in a hierarchical fashion – essentially a stepwise incorporation of the UTP-A, UTP-B, and UTP-C subcomplexes. These subcomplexes are made up of over 30 non ribosomal protein factors, the U3 snoRNP particle, a few Rps proteins, and the 35S pre-rRNA. Their exact role, though has not been discovered. [3] The composition of the pre-40S particle changes drastically once cleavage at the U3 snoRNPA dependent sites (sites A0, A1, and A2) are made. This cleavage event creates the 20S pre-rRNA and causes ribosomal factors to dissociate from the pre-40S particle. U3 is displaced from the nascent 40S by the helicase Dhr1. [12] At this point in the ribosome biogenesis process, the 40S pre-ribosome already shows the “head” and “body” structures of the mature 40S subunit. The 40S pre-ribosome is transported out of the nucleolus and into the cytoplasm. The cytoplasmic 40S pre-ribosome now contains ribosomal proteins, the 20s rRNA and a few non-ribosomal factors. The final formation of the 40S subunit “beak” structure occurs after a phosphorylation and dephosphorylation event involving the Enp1-Ltv1-Rps3 complex and the kinase, Hrr25. Cleavage of the 20S pre-rRNA at the D-site creates the mature 18s rRNA. This cleavage event is dependent on several non-ribosomal factors such as Nob1, Rio1, Rio2, Tsr1 and Fap7. [1]

60S subunit Edit

The maturation of the pre-60S subunit into a mature 60S subunit requires many biogenesis factors that associate and disassociate. In addition, some assembly factors associate with the 60S subunit while others only interact with it transiently. As an overall trend, the maturation of the pre-60S subunit is marked a gradual decrease in complexity. The subunit matures as it moves from the nucleolus to the cytoplasm and gradually the number of trans-acting factors are reduced. [3] The maturation of the 60S subunit requires the help of about 80 factors. Eight of these factors are directly involved with the processing of the 27S A3 pre-rRNA, which actually completes the formation of the mature 5’end of the 5.8S rRNA. The A3 factors bind to distant sites on the pre-RNA as well as to each other. Subsequently, they bring areas of rRNA close together and promote the processing of pre-rRNA and the recruitment of ribosomal proteins. Three AAA-type ATPases work to strip the factors from the maturing 60S pre-ribosome. One of the ATPases is a dynein-like Rea1 protein made up of 6 different ATPase domains that form a ring structure. The ring structure is attached to a flexible tail that happens to have a MIDAS (Metal ion-dependentant adhesion site) tip. The Rea1 interacts with the 60S pre-ribosome via its ring while two substrates, Ytm1 and Rsa1, interact with Rea1 through its MIDAS tip. The role of these substrates has not yet been defined. Both though, along with their interactions, are removed in the maturation process of the 60S pre-ribosome. The other two ATPases, Rix7 and Drg1 also function to remove assembly factors from the maturing 60S subunit. Helicases and GTPases are also involved in the removal of assembly factors and the rearrangement of RNA to form the completed 60S subunit. Once in the cytoplasm (see nuclear export), the 60S subunit further undergoes processing in order to be functional. The rest of the large subunit ribosomal particles associate with the 60S unit and the remaining non-ribosomal assembly factors disassociate. The release of the biogenesis factors is mediated mostly by GTPases such as Lsg1 and ATPases such as Drg1. The precise sequence of these events remains unclear. The pathway of 60S cytoplasmic maturation remains incomplete as far as current knowledge is concerned. [3]

In order for the pre-ribosomal units to fully mature, they must be exported to the cytoplasm. To effectively move from the nucleolus to the cytoplasm, the pre-ribosomes interact with export receptors to move through the hydrophobic central channel of the nuclear pore complex. [3] The karyopherin Crm1 is the receptor for both ribosomal subunits and mediates export in a Ran-GTP dependent fashion. It recognizes molecules that have leucine-rich nuclear export signals. The Crm1 is pulled to the large 60S subunit by the help of an adapter protein called Nmd3. The adapter protein for the 40S unit is unknown. In addition to Crm1, other factors play a role in nuclear export of pre-ribosomes. A general mRNA export receptor, called Mex67, as well as a HEAT-repeating-containing protein, Rrp12, facilitate the export of both subunits. These factors are non-essential proteins and help to optimize the export of the pre-ribosomes since they are large molecules. [3]

Because ribosomes are so complex, a certain number of ribosomes are assembled incorrectly and could potentially waste cellular energy and resources when synthesizing non-functional proteins. To prevent this, cells have an active surveillance system to recognize damaged or defective ribosomes and target them for degradation. The surveillance mechanism is in place to detect nonfunctional pre-ribosomes as well as nonfunctional mature ribosomes. In addition, the surveillance system brings the necessary degradation equipment and actually degrades the nonfunctional ribosomes. [1] Pre-ribosomes that build up in the nucleus are destroyed by the exosome, which is a multisubunit complex with exonuclease activity. If defective ribosomal subunits do happen to make it out of the nucleolus and into the cytoplasm, there is a second surveillance system in place there to target malfunctioning ribosomes in the cytoplasm for degradation. Certain mutations in residues of the large ribosome subunit will actually result in RNA decay and thus degradation of the unit. Because the amount of defects that are possible in ribosome assembly are so extensive, it is still unknown as to how the surveillance system detects all defects, but it has been postulated that instead of targeting specific defects, the surveillance system recognizes the consequences of those defects – such as assembly delays. Meaning, if there is a disruption in the assembly or maturation of a mature ribosome, the surveillance system will act as if the subunit is defective. [3]

Mutations in ribosome biogenesis are linked to several human ribosomopathy genetic diseases, including inherited bone marrow failure syndromes, which are characterized by a predisposition to cancer and a reduced number of blood cells. Ribosomal dysregulation may also play a role in muscle wasting. [13]


Рибосома

The ribosome gets started in a process called initiation. Several initiation factor proteins deliver the mRNA to the small subunit, line up the first tRNA, and guide the association with the large subunit. This structure ( 4v4j ), shows a special sequence in the mRNA, called the Shine-Delgarno sequence after its discoverers, which is associated with the last part of the RNA chain in the small subunit. This lines up the mRNA in the right place, making it ready for a special initiator tRNA. In the picture, the little piece of mRNA is shown in red and tRNA is shown in yellow.

A note about the picture: the mRNA, tRNA and protein factors all bind inside the ribosome, between the two subunits, so it is tricky to create a picture that shows what is happening. These pictures show the mRNA, tRNA and other molecules, along with a lightened picture of the ribosome to show their placement in the whole complex.

Удлинение

Прекращение

Антибиотики

Изучение структуры

Ribosome Decoding Center (PDB entry 2wdg)

The new structures of intact 70S ribosomes reveal the secret of life. This illustration shows a closeup of the "decoding center" of the ribosome (PDB entry 2wdg ). This is the place where an incoming tRNA anticodon (shown in yellow) is matched with an mRNA codon (shown in red). As you might imagine, it is essential that this match is perfect, so that only the proper tRNA is paired, and thus that only the correct amino acid is added to the growing chain. The ribosome uses several interactions to test this pairing, ensuring that the base pairing is correct. To look closely at these interactions, click on the image for an interactive Jmol.

Темы для дальнейшего обсуждения

  1. The ribosome is composed of two subunits that assemble around the mRNA into a functional complex. What are the advantages of this? Can you find other examples of molecules that surround RNA or DNA strands?
  2. Ribosomes are challenging molecules to study. As you are exploring the ribosome
  3. structures in the PDB, compare the different types of data that are used to support the structures, including crystallographic structures at atomic and near-atomic resolution and electron micrograph reconstructions at lower resolution.

Связанные ресурсы PDB-101

  • More about Ribosome
  • Browse Enzymes
  • Browse Protein Synthesis
  • Browse Drug Action
  • Browse Nobel Prizes and PDB structures
  • Browse Antimicrobial Resistance
  • Browse Nucleic Acids
  • Browse Molecular Evolution
  • Browse Central Dogma

Использованная литература

  1. A. Korostelev and H. F. Noler (2007) The ribosome in focus: new structures bring new insights. Trends in Biochemical Sciences 32, 434-441.
  2. T. A. Steitz (2008) A structural understanding of the dynamic ribosome machine. Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 242-253.
  3. T. M. Schmeing and V. Ramakrishnan (2009) What recent ribosome structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 461, 1234-1242.
  4. E. Zimmerman and A. Yonath (2009) Biological implications of the ribosome's stunning stereochemistry. ChemBioChem 10, 63-72.

January 2010, David Goodsell

О PDB-101

PDB-101 помогает учителям, студентам и широкой публике исследовать трехмерный мир белков и нуклеиновых кислот. Изучение их разнообразных форм и функций помогает понять все аспекты биомедицины и сельского хозяйства, от синтеза белка до здоровья и болезней до биологической энергии.

Почему PDB-101? Исследователи со всего мира делают эти трехмерные структуры бесплатно доступными в архиве Protein Data Bank (PDB). PDB-101 создает вводные материалы, чтобы помочь новичкам начать изучение предмета («101», как в курсе начального уровня), а также ресурсы для расширенного обучения.


Selective 40S Footprinting Reveals Cap-Tethered Ribosome Scanning in Human Cells

Translation regulation occurs largely during the initiation phase. Here, we develop selective 40S footprinting to visualize initiating 40S ribosomes on endogenous mRNAs in vivo. This reveals the positions on mRNAs where initiation factors join the ribosome to act and where they leave. We discover that in most human cells, most scanning ribosomes remain attached to the 5' cap. Consequently, only one ribosome scans a 5' UTR at a time, and 5' UTR length affects translation efficiency. We discover that eukaryotic initiation factor 3B (eIF3B,) eIF4G1, and eIF4E remain bound to 80S ribosomes as they begin translating, with a decay half-length of ∼12 codons. Hence, ribosomes retain these initiation factors while translating short upstream open reading frames (uORFs), providing an explanation for how ribosomes can reinitiate translation after uORFs in humans. This method will be of use for studying translation initiation mechanisms in vivo.

Ключевые слова: cap-tethering eukaryotic initiation factor mRNA cap reinitiation ribosome footprinting scanning translation initiation translational regulation.


Distinct regulatory ribosomal ubiquitylation events are reversible and hierarchically organized

Activation of the integrated stress response (ISR) or the ribosome-associated quality control (RQC) pathway stimulates regulatory ribosomal ubiquitylation (RRub) on distinct 40S ribosomal proteins, yet the cellular role and fate of ubiquitylated proteins remain unclear. We demonstrate that uS10 and uS5 ubiquitylation are dependent upon eS10 or uS3 ubiquitylation, respectively, suggesting that a hierarchical relationship exists among RRub events establishing a ubiquitin code on ribosomes. We show that stress dependent RRub events diminish after initial stimuli and that demodification by deubiquitylating enzymes contributes to reduced RRub levels during stress recovery. Utilizing an optical RQC reporter we identify OTUD3 and USP21 as deubiquitylating enzymes that antagonize ZNF598-mediated 40S ubiquitylation and can limit RQC activation. Critically, cells lacking USP21 or OTUD3 have altered RQC activity and delayed eS10 deubiquitylation indicating a functional role for deubiquitylating enzymes within the RQC pathway.

Ключевые слова: OTUD3 USP21 ZNF598 cell biology deubiquitylating enzymes human ribosome ubiquitylation ribosome-associated quality control.

Резюме на простом языке

Ribosomes are cellular machines that build proteins by latching on and then reading template molecules known as mRNAs. Several ribosomes may be moving along the same piece of mRNA at the same time, each making their own copy of the same protein. Damage to an mRNA or other problems may cause a ribosome to stall, leading to subsequent collisions. A quality control pathway exists to identify stalled ribosomes and fix the ‘traffic jams’. It relies on enzymes that tag halted ribosomes with molecules known as ubiquitin. The cell then removes these ribosomes from the mRNA and destroys the proteins they were making. Afterwards, additional enzymes take off the ubiquitin tags so the cell can recycle the ribosomes. These enzymes are key to signaling the end of the quality control event, yet their identity was still unclear. Garshott et al. used genetic approaches to study traffic jams of ribosomes in mammalian cells. The experiments showed that cells added sets of ubiquitin tags to stalled ribosomes in a specific order. Two enzymes, known as USP21 and OTUD3, could stop this process this allowed ribosomes to carry on reading mRNA. Further work revealed that the ribosomes in cells that produce higher levels of USP21 and OTUD3 were less likely to stall on mRNA. On the other hand, ribosomes in cells lacking USP1 and OTUD3 retained their ubiquitin tags for longer and were more likely to stall. The findings of Garshott et al. reveal that USP21 and OTUD3 are involved in the quality control pathway which fixes ribosome traffic jams. In mice, problems in this pathway have been linked with neurons dying or being damaged because toxic protein products start to accumulate in cells this is similar to what happens in human conditions such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Using ubiquitin to target and potentially fix the pathway could therefore open the door to new therapies.


Смотреть видео: Строение клетки. Митохондрии. Пластиды. Органоиды движения. Видеоурок по биологии 10 класс (December 2022).