Информация

Разница между вирусной и нативной РНК

Разница между вирусной и нативной РНК


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я специалист по данным, практически не имеющий подготовки в области микробиологии. Я надеюсь, что вы все простите мое невежество за эти вопросы. Внимание, которое недавно привлек COVID-19, заставило меня задуматься: в чем принципиальное различие между вирусной РНК и РНК, присущей конкретной клетке?

Я имею в виду, что нам часто говорят в школе, что вирусы захватывают производственные мощности клеток, чтобы выразить свой собственный генетический материал. Клетка производит столько вирусного белка, что в конечном итоге (например) лизируется. Но что заставляет клетку производить столько вирусных белков? Как клетка не производит слишком много белков из собственной ДНК клетки?

Я подозреваю, что ответ сводится к отсутствию регуляции генов вирусной РНК. Но действительно ли каждый ген, свойственный клетке, подлежит какой-либо регуляции? Если да, то является ли реальная опасность вирусов отсутствием какого-либо регулирования? Тогда это, кажется, довольно легко обнаружить - по крайней мере, теоретически. Другими словами, клетка или ученый могут обозначить последовательность РНК как опасную просто потому, что она не регулируется, независимо от того, произошла ли она от вируса.

Второй вопрос: нам говорят, что вирусные белки самостоятельно собирают и инкапсулируют копии вирусной РНК просто случайно. Не кажется ли это маловероятным? Действительно ли компоненты вируса настолько распространены в клетке, что вирус будет самособираться, включая все свои необходимые компоненты, значительную часть времени? Я подозреваю, что для этого потребуется много раз скопировать РНК вируса, чтобы она была в изобилии. Затем мы возвращаемся к тому же вопросу, что и выше. Уникальна ли вирусная РНК в том, что она копируется бесконечно?


Нет принципиальной разницы между вирусной РНК и нативной клеточной РНК, кроме последовательности оснований РНК в них. Биохимически различия в последовательностях РНК не проявляются, только в белковых продуктах, полученных из РНК.

Регулирование нативной РНК осуществляется множеством различных способов (в клетке ничего не меняется). разработан; все для этого случая, так что любая случайная случайность может быть установлена). Естественная регуляция имеет важное значение, иначе произойдет неконтролируемое производство, что приведет к гибели клеток или к раку.

Большая, если не большая часть нативной регуляции осуществляется путем регулирования транскрипции ДНК в РНК. Как только РНК оказывается в цитозоле, дальнейшая регуляция практически не выполняется, поэтому вирусная РНК в цитозоле управляется фабрикой клеточного белка. Но, по крайней мере, некоторые вирусы приобрели дополнительные преимущества, которые помогают их РНК превосходить нативные мРНК за использование белкового аппарата (см., Например, Взлом аппарата трансляции РНК-вирусами).

Так что на самом деле нелегко «пометить последовательность РНК как опасную просто потому, что она не регулируется», поскольку широкий спектр нормальных РНК в цитозоле не дает основания для определения того, являются ли какие-либо «нерегулируемыми», и клетка не может быть защищенным таким образом.

Самосборка широко распространена в нормальных клеточных функциях, а также в производстве вирусов. У участвующих молекул есть давно отточенные точки притяжения для своих молекул-партнеров, и в колеблющемся молекулярном супе клетки молекулы могут вскоре столкнуться друг с другом и соединиться. Благодаря неконтролируемому производству вируса новые вирусные частицы имеют множество молекул-компонентов, доступных для этой сборки.


(Если вам интересно, что я отправляю два ответа, это потому, что в этом q-сообщении было задано два вопроса в одном.)

Что касается вопроса о самосборке вирусов… изучение этого вопроса действительно было сложной задачей. Об этом есть недавняя (2019 г.) статья PNAS:

Несмотря на десятилетия исследований, самосборка капсидов оставалась загадкой, поскольку не существовало методов измерения кинетики сборки отдельных капсидов. Мы преодолеваем это препятствие, используя метод чувствительной микроскопии, основанный на лазерной интерферометрии. Измерения показывают, что небольшое ядро ​​белков должно сформироваться на вирусной РНК до того, как соберется капсид.

Обзор измерения. (A) Структурная модель капсида MS2 (PDB ID: 2 мс2) показывает его небольшой размер и структуру T = 3. Две конфигурации димера белка оболочки показаны серым и пурпурным. (B) Мы вводим раствор несобранных димеров поверх покровного стекла, на котором цепи РНК MS2 связаны ДНК-связями. Когда димеры связываются с РНК, полученные частицы рассеивают свет. Частицы выглядят как темные пятна с ограничением дифракции из-за деструктивной интерференции между рассеянным светом и опорным лучом. (C) Мы отслеживаем множество таких точек параллельно. Показано типичное изображение поля зрения, снятое через 126 с после добавления 2-мкм димеров и представляющее в среднем 1000 кадров, снятых со скоростью 1000 кадров в секунду. (D) Интенсивность каждого пятна пропорциональна количеству связанных белков внутри каждой частицы, и изменения интенсивности как функция времени показывают кинетику сборки каждой частицы. Чем темнее пятно, тем больше его интенсивность. (D, вверху) Временные ряды изображений для точки в рамке на C. (D, внизу) График интенсивности для того же места с использованием среднего значения за 1000 кадров. Мы обсуждаем взаимосвязь между интенсивностью и количеством связанных белков, а также то, как мы рассчитываем интенсивность пятна, в материалах и методах и Приложении SI.

Некоторые видео также размещены в Приложении.

И еще немного о наблюдаемой динамике:

Мы обнаружили, что «время роста», время, необходимое частице для достижения размера полного капсида после того, как она зародится, варьируется от частицы к частице в пределах от 30 до более 200 с (рис. 2A и приложение SI, рис. S1). Из частиц, которые вырастают в полный капсид, некоторые растут с постоянной скоростью, другие медленно по мере приближения к завершению, а третьи содержат промежуточные паузы продолжительностью до 25 с (Рис. 2A и Приложение SI, Рис. S1). Несмотря на эти различия, по существу все трассы монотонны, с небольшими заметными этапами разборки или без них.

Так что да, что довольно интересно, вирусный капсид просто строится и строится сам; даже если потребуется «перерыв на обед», это не проблема, чтобы значительно изменить ход сборки.

Режим (ы) сбоя этого процесса самосборки на самом деле связан с созданием / привлечением «слишком большого количества материала», или двух (или более) вирусных РНК, запутанных в общих белковых осколках, которые они (все) привлекают. Обычно слишком большая плотность строительных материалов может привести к проблемам…

Время роста также уменьшается с увеличением концентрации белка, но медленнее, чем время зародышеобразования (рис. 4A) [ниже]. Таким образом, мы заключаем, что РНК, которая способствует зародышеобразованию при низкой концентрации белка, создает конкуренцию между зародышеобразованием и ростом, которая может приводить к разрастанию структур при более высокой концентрации, как показано на рис. 4B. Этот путь обеспечивает возможное объяснение структур «монстр» (5) и «мультиплет» (19), наблюдаемых с другими РНК-вирусами.


Я в основном согласен с mgkrebbs (+1), но обратите внимание, что, хотя у вирусов обычно есть какая-то субъединица РНК-репликазы (RdRP), чтобы помочь им, вироиды полностью их не имеют, но умеют воспроизводить:

В то время как РНК-вирусы кодируют субъединицы ферментативного комплекса (РНК-репликазы), который катализирует инициирование и удлинение цепей вирусной РНК, вироиды должны полагаться на этом этапе репликации на уже существующие РНК-полимеразы хозяина. В принципе, лучшими кандидатами будут РНК-зависимые РНК-полимеразы, о существовании которых в растениях известно давно. Однако вироиды не используют эти ферменты для своей репликации, а используют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, перенаправленные на принятие матриц РНК.

Наиболее близким к вироиду у людей является гепатит D. До прошлого года считалось, что это в основном человеческое заболевание, но исследование 2019 года показало, что аналоги HepD довольно широко распространены у беспозвоночных, рыб, змей и т. Д.

Вирусы «гораздо более опасны», чем вироиды в отношении репликации, потому что

Вирусы с положительной цепью РНК реплицируются с помощью кодируемых вирусами РНК-зависимых РНК-полимераз (RdRP), которые обеспечивают прямую функцию репликации РНК-РНК, не обнаруживаемую в клетках-хозяевах.

Некоторые недавние исследования показывают, что RdRP были независимо потеряны во многих кладах животных. По иронии судьбы, роль этих (бывших) хозяев RdRPs [наиболее вероятно] заключалась в обеспечении противовирусного механизма посредством молчания РНК (см. [Раздел] ниже для деталей), но эволюция предоставила альтернативные механизмы хозяина для их производства.

Хотя можно распознать [ядро] вирусных RdRP в программном обеспечении, неясно / неизвестно, как преобразовать это в общую антивирусную стратегию, насколько мне известно, из-за их довольно существенных вариаций. (В общем, недостаточно знать генетическую последовательность, кодирующую RdRP какого-либо вируса, чтобы даже провести скрининг ингибиторов на него; кроме того, необходимо знать кристаллическую структуру комплекса RdRP для этого вируса.)


Если вас интересует «внутриклеточная» (т.е. основанная на РНК) противовирусная защита… существуют подобные механизмы, но они существенно более сложные (чем вы предлагаете), основанные вместо этого на подавлении РНК:

В противовирусном иммунитете на основе эукариотической РНК двухцепочечная вирусная РНК распознается как ассоциированный с патогеном молекулярный паттерн и преобразуется в малые интерферирующие РНК (миРНК) с помощью Dicer рибонуклеазы хозяина. В некоторых случаях после амплификации с помощью РНК-зависимых РНК-полимераз хозяина эти siРНК, полученные из вируса, направляют специфический противовирусный иммунитет посредством РНК-интерференции и связанных эффекторных механизмов подавления РНК.

Ключевые этапы создания противовирусного иммунитета на основе РНК, индуцированного у Drosophila melanogaster инфекцией РНК-вирусов с положительной цепью, таких как вирус птичников. После проникновения и снятия оболочки вирионов вируса птичников (FHV) геномная РНК с положительной цепью ((+) РНК) служит как мРНК для трансляции вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), так и матрицей для синтеза антигеномная РНК с отрицательной цепью ((-) РНК). Предпочтительное производство (+) РНК вирусным RdRP достигается за счет нескольких раундов инициации синтеза РНК с 3'-конца малонаселенной (-) РНК. Образовавшаяся двухцепочечная РНК (дцРНК), образованная между 5'-концевой (+) РНК растущего потомства и (-) РНК-матрицей, распознается Dicer 2 (DCR2) и расщепляется на малые интерферирующие РНК (миРНК), тем самым запуская РНК- на основе противовирусного иммунитета. Вирусные миРНК собираются с Argonaute 2 (AGO2) в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), метилируются на 3'-конце (показан черным кружком) с помощью HEN1 и используются для управления специфическим клиренсом РНК FHV. В качестве противодействия FHV кодирует вирусный супрессор молчания РНК, белок B2, который нацелен на два этапа этого иммунного пути: ингибирование продукции вирусной siRNA путем связывания с вирусным RdRP и вирусным предшественником dsRNA и секвестрация вирусных siRNA посредством связывающие дуплексные миРНК. Loqs-PD, болтун-изоформа PD.

И да, RdRP вирусов (наиболее важная часть самокопировальной машины, с которой они идут) является важной мишенью для лекарств, например

CoV используют механизм репликации / транскрипции, состоящий из нескольких субъединиц. Набор неструктурных белков (nsp), продуцируемых как продукты расщепления вирусных полипротеинов ORF1a и ORF1ab (5), собирается для облегчения репликации и транскрипции вируса. Ключевой компонент, РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp, также известная как nsp12), катализирует синтез вирусной РНК и, таким образом, играет центральную роль в цикле репликации и транскрипции вируса COVID-19, возможно, с помощью nsp7 и nsp8 в качестве кофакторов (6). Таким образом, Nsp12 считается основной мишенью для антивирусных ингибиторов нуклеотидных аналогов, таких как ремдезивир, который демонстрирует потенциал для лечения вирусных инфекций COVID-19 (7, 8). […]

Эффективность аналогов нуклеотидов, завершающих цепь, требует, чтобы вирусные RdRps распознавали и успешно включали активную форму ингибиторов в растущую цепь РНК.

Поэтому, хотя обнаруживать вирусы и бороться с ними не так просто, как вы предложили, некоторые стратегии репликации включают в себя либо «загромождение собственного (RdRP) копировального аппарата поддельными частями» (как, например, ремдесивир), либо создание [надеюсь] такого же количества »копий канцлера », для которых механизм подавления РНК фактически использует части самих вирусных копий.


Сравнение и оценка методов количественного определения РНК с использованием вирусной, прокариотической и эукариотической РНК в диапазоне концентраций 10 (4)

Количественная оценка РНК важна для различных исследований молекулярной биологии. В этой работе были оценены три метода количественной оценки: поглощение ультрафиолетового (УФ) излучения, микрокапиллярный электрофорез (МКЭ) и количественное определение на основе флуоресценции. РНК вирусов, бактерий и эукариот измеряли в диапазоне от 500 до 0,05 нг микроль (-1) с помощью спектрофотометра ND-1000 (УФ), набора Agilent RNA 6000 (MCE) и анализа Quant-iT RiboGreen (флуоресценция). Прецизионность и точность каждого метода оценивались и сравнивались с концентрацией, полученной независимо с использованием оптической эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES). При оценке также учитывались стоимость, время и навыки оператора, а также требуемые объемы образцов. Результаты показывают идеальный диапазон концентраций для каждого метода количественной оценки для оптимизации точности и прецизионности. Спектрофотометр ND-1000 демонстрирует высокую точность и точно определяет образец объемом 1 мкл в диапазоне от 500 до 5 нг мкр (-1). Анализ Quant-iT RiboGreen демонстрирует высокую точность в диапазоне от 1 до 0,05 нг микрол (-1), но ограничен более низкими концентрациями РНК и является более дорогостоящим, чем спектрофотометр ND-1000. Наборы Agilent демонстрируют меньшую точность, чем спектрофотометр ND-1000 и тесты Quant-iT RiboGreen в диапазоне от 500 до 0,05 нг микрол (-1). Однако наборы Agilent требуют 1 мкл образца и могут определять целостность РНК, что является полезной функцией для проверки успешности процесса выделения.


Популяции вирусов не растут путем деления клеток, потому что они не являются клетками. Вместо этого они используют механизмы и метаболизм клетки-хозяина для создания новых копий самих себя. После заражения клетки-хозяина вирион использует рибосомы клетки, ферменты, АТФ и другие компоненты для репликации. Вирусы различаются по тому, как они это делают. Например:

  • Некоторые РНК-вирусы транслируются непосредственно в вирусные белки в рибосомах клетки-хозяина. Рибосомы хозяина обрабатывают вирусную РНК, как если бы это была собственная мРНК хозяина.
  • Некоторые ДНК-вирусы сначала транскрибируются в клетке-хозяине в вирусную мРНК. Затем вирусная мРНК транслируется рибосомами клетки-хозяина в вирусные белки.

В любом случае вновь созданные вирусные белки собираются с образованием новых вирионов. Затем вирионы могут управлять производством фермента, разрушающего стенку клетки-хозяина. Это позволяет вирионам вырываться из клетки. Клетка-хозяин при этом разрушается. Недавно выпущенные вирусные частицы могут инфицировать другие клетки хозяина.

Репликация РНК-вирусов

An РНК-вирус представляет собой вирус, генетическим материалом которого является РНК. Их нуклеиновая кислота обычно представляет собой одноцепочечную РНК, но может быть двухцепочечной РНК. Важные патогенные РНК-вирусы человека включают вирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), вирус гриппа и вирус гепатита C. РНК-вирусы животных можно разделить на разные группы в зависимости от типа их репликации.

  • Некоторые РНК-вирусы используют свой геном напрямую, как если бы это была мРНК. Вирусная РНК транслируется непосредственно в новые вирусные белки после заражения вирусом.
  • Некоторые РНК-вирусы несут ферменты, которые позволяют их РНК-геному действовать как матрица для клетки-хозяина для формирования вирусной мРНК.
  • Ретровирусы использовать промежуточные соединения ДНК для репликации. Обратная транскриптазавирусный фермент, происходящий из самого вируса, превращает вирусную РНК в комплементарную цепь ДНК, которая копируется с образованием двухцепочечной молекулы вирусной ДНК. Затем эта вирусная ДНК транскрибируется и транслируется механизмом хозяина, управляя образованием новых вирионов. Нормальная транскрипция включает синтез РНК из ДНК, следовательно, обратная транскрипция - это задний ход этого процесса. Это исключение из центральной догмы молекулярной биологии.

Репликация ДНК-вирусов

А ДНК-вирус представляет собой вирус, который имеет ДНК в качестве генетического материала и реплицируется с помощью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Нуклеиновая кислота обычно представляет собой двухцепочечную ДНК, но также может быть одноцепочечной ДНК. ДНК ДНК-вирусов транскрибируется в мРНК клеткой-хозяином. Затем вирусная мРНК транслируется в вирусные белки. Затем эти вирусные белки собираются с образованием новых вирусных частиц.

Вирусы с обратной транскрипцией

А вирус с обратной транскрипцией представляет собой любой вирус, который реплицируется с использованием обратной транскрипции, то есть образования ДНК из матрицы РНК. Некоторые вирусы с обратной транскрипцией имеют геномы, состоящие из одноцепочечной РНК, и для репликации используют промежуточные ДНК. Другие в этой группе имеют геномы с двухцепочечной ДНК и используют промежуточную РНК во время репликации генома. Ретровирусы, как упоминалось выше, входят в эту группу, в которую входит ВИЧ. Некоторые вирусы с двухцепочечной ДНК реплицируются с использованием обратной транскриптазы. Вирус гепатита В - один из этих вирусов.

Бактериофаги

Бактериофаги вирусы, поражающие бактерии. Они связываются с поверхностными рецепторными молекулами бактериальной клетки, а затем их геном попадает в клетку. Белковая оболочка не попадает в бактерии. В течение короткого промежутка времени, а в некоторых случаях всего за несколько минут, бактериальная полимераза начинает переводить вирусную мРНК в белок. Эти белки становятся либо новыми вирионами внутри клетки, либо вспомогательными белками, которые помогают сборке новых вирионов, либо белками, участвующими в лизисе клетки. Вирусные ферменты способствуют разрушению клеточной мембраны. С некоторыми фагами всего через двадцать минут после того, как фаг заражает бактерию, более трехсот фагов могут быть собраны и выпущены из организма-хозяина.


СОДЕРЖАНИЕ

Подготовка библиотеки Править

Общие шаги по подготовке библиотеки комплементарной ДНК (кДНК) для секвенирования описаны ниже, но часто варьируются в зависимости от платформы. [8] [3] [9]

  1. Выделение РНК:РНК выделяют из ткани и смешивают с дезоксирибонуклеазой (ДНКазой). ДНКаза уменьшает количество геномной ДНК. Степень деградации РНК проверяется с помощью гель-электрофореза и капиллярного электрофореза и используется для присвоения пробе числа целостности РНК. Это качество РНК и общее количество исходной РНК учитываются на последующих этапах подготовки библиотеки, секвенирования и анализа.
  1. Выбор / истощение РНК: Для анализа представляющих интерес сигналов выделенную РНК можно оставить как есть, отфильтровать на РНК с 3'-полиаденилированными (поли (A)) хвостами, чтобы включить только мРНК, лишенную рибосомной РНК (рРНК), и / или отфильтровать для РНК, которая связывает определенные последовательности (Методы отбора и истощения РНК Таблица ниже). РНК с 3'-поли (A) хвостами в основном состоит из зрелых процессированных кодирующих последовательностей. Селекция поли (А) осуществляется путем смешивания РНК с поли (Т) олигомерами, ковалентно прикрепленными к субстрату, обычно магнитным шарикам. [10] [11] Выбор поли (A) имеет важные ограничения в определении биотипа РНК. Многие биотипы РНК не полиаденилированы, в том числе многие некодирующие РНК и транскрипты гистонового ядра белка, или регулируются длиной их поли (А) хвоста (например, цитокины) и, таким образом, могут не обнаруживаться после поли (А) отбора. [12] Кроме того, поли (A) отбор может увеличить 3'-смещение, особенно с РНК более низкого качества. [13] [14] Этих ограничений можно избежать с помощью обеднения рибосом, удаления рРНК, которая обычно составляет более 90% РНК в клетке. Стадии обогащения поли (A) и истощения рибосом являются трудоемкими и могут вносить систематические ошибки, поэтому были разработаны более простые подходы, позволяющие исключить эти шаги. [15] Малые РНК-мишени, такие как миРНК, могут быть дополнительно выделены путем отбора по размеру с помощью гелей для исключения, магнитных шариков или коммерческих наборов.
  1. синтез кДНК: РНК обратно транскрибируется в кДНК, потому что ДНК более стабильна и позволяет проводить амплификацию (в которой используются ДНК-полимеразы) и использовать более зрелую технологию секвенирования ДНК. Амплификация после обратной транскрипции приводит к потере цепочечности, чего можно избежать с помощью химического мечения или секвенирования одной молекулы. Фрагментация и выбор размера выполняются для очистки последовательностей, которые имеют подходящую длину для секвенатора. РНК, кДНК или и то и другое фрагментируются ферментами, обработкой ультразвуком или распылителями. Фрагментация РНК снижает 5'-смещение произвольно праймированной обратной транскрипции и влияние сайтов связывания праймеров [11] с обратной стороной, заключающейся в том, что 5'- и 3'-концы превращаются в ДНК менее эффективно. За фрагментацией следует выбор размера, при котором либо удаляются небольшие последовательности, либо выбирается узкий диапазон длин последовательностей. Поскольку малые РНК, такие как miRNA, теряются, они анализируются независимо. КДНК для каждого эксперимента может быть проиндексирована штрих-кодом гексамера или октамера, так что эти эксперименты могут быть объединены в одну дорожку для мультиплексного секвенирования.

Секвенирование комплементарной ДНК (cDNA-Seq) Править

Библиотека кДНК, полученная из биотипов РНК, затем секвенируется в машиночитаемый формат. Существует множество высокопроизводительных технологий секвенирования для секвенирования кДНК, включая платформы, разработанные Illumina, Thermo Fisher, BGI / MGI, PacBio и Oxford Nanopore Technologies. [16] Для короткочтенного секвенирования Illumina, распространенной технологии секвенирования кДНК, адаптеры лигируются к кДНК, ДНК прикрепляется к проточной ячейке, кластеры генерируются в циклах амплификации и денатурирования мостика, а последовательность синтеза - выполняется в циклах синтеза комплементарной цепи и лазерного возбуждения оснований с обратимыми терминаторами. Выбор и параметры платформы для секвенирования основываются на дизайне эксперимента и стоимости. Общие соображения по дизайну эксперимента включают выбор длины секвенирования, глубины секвенирования, использования секвенирования с одним или парным концом, количества повторов, мультиплексирования, рандомизации и дополнительных значений. [17]

Секвенирование малой / некодирующей РНК Править

При секвенировании РНК, отличной от мРНК, подготовка библиотеки изменяется. Клеточная РНК выбирается на основе желаемого диапазона размеров. Для малых РНК-мишеней, таких как миРНК, РНК выделяют путем отбора по размеру. Это может быть выполнено с помощью геля для исключения по размеру, с помощью магнитных шариков для выбора размера или с помощью коммерчески разработанного набора. После выделения линкеры добавляют к 3'- и 5'-концам, а затем очищают. Последний шаг - создание кДНК посредством обратной транскрипции.

Прямое секвенирование РНК Править

Поскольку преобразование РНК в кДНК, лигирование, амплификация и другие манипуляции с образцами, как было показано, вносят систематические ошибки и артефакты, которые могут мешать как правильной характеристике, так и количественной оценке транскриптов, [18] прямое секвенирование РНК одной молекулы было исследовано компаниями, включая Helicos. (банкрот), Oxford Nanopore Technologies, [19] и другие. Эта технология обеспечивает прямую параллельную последовательность молекул РНК.

Секвенирование одной молекулы РНК в реальном времени Править

Массивно параллельная прямая RNA-Seq с одной молекулой была исследована как альтернатива традиционной RNA-Seq, в которой преобразование РНК в кДНК, лигирование, амплификация и другие этапы манипуляции с образцом могут вносить систематические ошибки и артефакты. [20] Технологические платформы, которые выполняют РНК-секвенирование одной молекулы в реальном времени, включают секвенирование нанопор Oxford Nanopore Technologies (ONT), [19] PacBio IsoSeq и Helicos (банкрот). Секвенирование РНК в ее нативной форме сохраняет модификации, такие как метилирование, что позволяет исследовать их напрямую и одновременно. [19] Еще одним преимуществом одномолекулярного RNA-Seq является то, что транскрипты могут быть покрыты по всей длине, что обеспечивает более высокую достоверность обнаружения и количественной оценки изоформ по сравнению с секвенированием с коротким считыванием. Традиционно методы одномолекулярной RNA-Seq имеют более высокий уровень ошибок по сравнению с секвенированием с коротким считыванием, но более новые методы, такие как ONT direct RNA-Seq, ограничивают ошибки, избегая фрагментации и преобразования кДНК. Недавнее использование ONT direct RNA-Seq для дифференциальной экспрессии в популяциях клеток человека продемонстрировало, что эта технология может преодолеть многие ограничения короткого и длинного секвенирования кДНК. [21]

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-Seq) Править

Стандартные методы, такие как микроматрицы и стандартный объемный анализ РНК-Seq, анализируют экспрессию РНК из больших популяций клеток. В смешанных популяциях клеток эти измерения могут скрыть важные различия между отдельными клетками в этих популяциях. [22] [23]

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-Seq) обеспечивает профили экспрессии отдельных клеток. Хотя невозможно получить полную информацию о каждой РНК, экспрессируемой каждой клеткой, из-за небольшого количества доступного материала, образцы экспрессии генов могут быть идентифицированы с помощью анализа кластеризации генов. Это может раскрыть существование в популяции клеток редких типов клеток, которые, возможно, никогда раньше не наблюдались. Например, редкие специализированные клетки в легких, называемые легочными ионоцитами, которые экспрессируют регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе, были идентифицированы в 2018 году двумя группами, выполняющими scRNA-Seq на эпителии дыхательных путей легких. [24] [25]

Экспериментальные процедуры Править

Текущие протоколы scRNA-Seq включают следующие этапы: выделение отдельной клетки и РНК, обратная транскрипция (RT), амплификация, создание библиотеки и секвенирование. Отдельные клетки либо механически разделяются на микролунки (например, BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform или CellMicrosystems CellRaft), либо инкапсулируются в капли (например, 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [26] Одиночные клетки маркируются добавлением шариков со штрих-кодированными олигонуклеотидами. Как клетки, так и шарики поставляются в ограниченных количествах, так что совместное заселение несколькими клетками и шариками является очень редким явлением. После завершения обратной транскрипции кДНК из многих клеток могут быть смешаны вместе для секвенирования транскриптов из конкретной клетки, идентифицируемых уникальным штрих-кодом каждой клетки. [27] [28] Уникальный молекулярный идентификатор (UMI) может быть прикреплен к последовательностям-мишеням мРНК / кДНК, чтобы помочь идентифицировать артефакты во время подготовки библиотеки. [29]

Проблемы для scRNA-Seq включают сохранение исходного относительного количества мРНК в клетке и идентификацию редких транскриптов. [30] Этап обратной транскрипции имеет решающее значение, поскольку эффективность реакции RT определяет, какая часть популяции РНК клетки будет в конечном итоге проанализирована секвенатором. Процессивность обратных транскриптаз и используемые стратегии прайминга могут влиять на продукцию полноразмерной кДНК и создание библиотек, смещенных в сторону 3 ’или 5’ конца генов.

На стадии амплификации в настоящее время для амплификации кДНК используется либо ПЦР, либо транскрипция in vitro (IVT). Одним из преимуществ методов на основе ПЦР является возможность генерировать полноразмерную кДНК. Однако различная эффективность ПЦР для конкретных последовательностей (например, содержимого GC и структуры snapback) также может быть экспоненциально усилена, создавая библиотеки с неравномерным покрытием. С другой стороны, хотя библиотеки, созданные с помощью IVT, могут избежать смещения последовательности, вызванного ПЦР, определенные последовательности могут транскрибироваться неэффективно, что вызывает выпадение последовательности или генерирование неполных последовательностей. [31] [22] Было опубликовано несколько протоколов scRNA-Seq: Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz. -seq [37] и C1-CAGE. [38] Эти протоколы различаются с точки зрения стратегий обратной транскрипции, синтеза и амплификации кДНК, а также возможности использования штрих-кодов, специфичных для последовательности (например, UMI), или способности обрабатывать объединенные образцы. [39]

В 2017 году были внедрены два подхода для одновременного измерения экспрессии мРНК и белка в отдельных клетках с помощью меченных олигонуклеотидами антител, известных как REAP-seq, [40] и CITE-seq. [41]

Приложения Править

scRNA-Seq все чаще используется в биологических дисциплинах, включая развитие, неврологию, [42] онкологию, [43] [44] [45] аутоиммунные заболевания [46] и инфекционные заболевания. [47]

scRNA-Seq предоставил значительное понимание развития эмбрионов и организмов, включая червя. Caenorhabditis elegans, [48] и регенеративная планария Schmidtea mediterranea. [49] [50] Первыми позвоночными животными, которые были нанесены на карту таким образом, были рыбки данио [51] [52] и Xenopus laevis. [53] В каждом случае были изучены несколько стадий эмбриона, что позволило картировать весь процесс развития на клеточной основе. [8] Наука признала эти достижения прорывом 2018 года. [54]

Экспериментальные соображения Править

При разработке и проведении экспериментов по RNA-Seq учитываются самые разные параметры:

  • Тканевая специфичность: Экспрессия генов варьируется внутри и между тканями, и RNA-Seq измеряет это сочетание типов клеток. Это может затруднить выделение интересующего биологического механизма. Секвенирование одной клетки можно использовать для изучения каждой клетки в отдельности, что устраняет эту проблему.
  • Временная зависимость: Экспрессия генов со временем меняется, и RNA-Seq делает только снимок. Можно проводить эксперименты с течением времени, чтобы наблюдать изменения в транскриптоме.
  • Покрытие (также известное как глубина): РНК содержит те же мутации, которые наблюдаются в ДНК, и для обнаружения требуется более глубокий охват. При достаточно высоком покрытии RNA-Seq можно использовать для оценки экспрессии каждого аллеля. Это может дать представление о таких явлениях, как импринтинг или цис-регуляторные эффекты. Глубина секвенирования, необходимая для конкретных приложений, может быть экстраполирована на основе экспериментального эксперимента. [55]
  • Артефакты генерации данных (также известные как технические отклонения): Реагенты (например, набор для подготовки библиотеки), задействованный персонал и тип секвенатора (например, Illumina, Pacific Biosciences) могут привести к техническим артефактам, которые могут быть неверно интерпретированы как значимые результаты. Как и в любом научном эксперименте, разумно проводить RNA-Seq в хорошо контролируемой обстановке. Если это невозможно или исследование представляет собой метаанализ, другим решением является обнаружение технических артефактов путем определения скрытых переменных (обычно анализ главных компонентов или факторный анализ) с последующей корректировкой этих переменных. [56]
  • Управление данными: Единичный эксперимент RNA-Seq на людях обычно составляет 1-5 Гб (сжатый) или больше, если включает промежуточные файлы. [57] Такой большой объем данных может создавать проблемы с хранением. Одним из решений является сжатие данных с использованием многоцелевых вычислительных схем (например, gzip) или схем, специфичных для геномики. Последние могут быть основаны на эталонных последовательностях или de novo. Другое решение - провести эксперименты с микрочипами, которых может быть достаточно для работы, основанной на гипотезах, или исследований репликации (в отличие от исследовательских исследований).

Сборка транскриптома Править

Два метода используются для присвоения считывания необработанной последовательности геномным признакам (т. Е. Сборки транскриптома):

  • De novo: Этот подход не требует эталонного генома для реконструкции транскриптома и обычно используется, если геном неизвестен, неполный или существенно изменен по сравнению с эталоном. [58] Проблемы при использовании коротких чтений для сборки de novo включают: 1) определение того, какие чтения следует объединить в непрерывные последовательности (контиги), 2) устойчивость к ошибкам секвенирования и другим артефактам и 3) вычислительную эффективность. Первичный алгоритм, используемый для сборки de novo, перешел от графов перекрытия, которые идентифицируют все попарные перекрытия между чтениями, к графам де Брейна, которые разбивают чтение на последовательности длины k и сворачивают все k-мерки в хеш-таблицу. [59] Графики перекрытия использовались при секвенировании по Сэнгеру, но они плохо масштабируются до миллионов считываний, созданных с помощью RNA-Seq. Примерами ассемблеров, использующих графы де Брейна, являются Trinity, [58] Oases [60] (производные от ассемблера генома Velvet [61]), Bridger [62] и rnaSPAdes. [63] Парное секвенирование и длинное считывание одного и того же образца может смягчить недостатки в коротком секвенировании считывания, выступая в качестве шаблона или скелета. Метрики для оценки качества сборки de novo включают среднюю длину контига, количество контигов и N50. [64]
  • Направляемый геном: Этот подход основан на тех же методах, которые используются для выравнивания ДНК, с дополнительной сложностью выравнивания считываний, которые охватывают прерывистые части эталонного генома. [65] Эти прерывистые чтения являются результатом секвенирования сплайсированных транскриптов (см. Рисунок). Как правило, алгоритмы выравнивания состоят из двух этапов: 1) выравнивание коротких участков считываемых данных (т. Е. Засеивание генома) и 2) использование динамического программирования для поиска оптимального выравнивания, иногда в сочетании с известными аннотациями. Программные инструменты, использующие выравнивание на основе генома, включают Bowtie, [66] TopHat (который основан на результатах BowTie для выравнивания сплайсинговых соединений), [67] [68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] и GMAP. . [71] Результаты инструментов геномного ориентированного выравнивания (картирования) могут быть дополнительно использованы такими инструментами, как Cufflinks [68] или StringTie [72], для восстановления непрерывных последовательностей транскриптов (т.е., файл FASTA). Качество управляемой геномом сборки можно измерить с помощью 1) показателей сборки de novo (например, N50) и 2) сравнений с известными транскриптами, сплайсинговыми соединениями, геномами и последовательностями белков с использованием точности, отзыва, или их комбинация (например, оценка F1). [64] Кроме того, in silico оценка может быть выполнена с использованием имитационных чтений. [73] [74]

Примечание по качеству сборки: Текущий консенсус заключается в том, что 1) качество сборки может варьироваться в зависимости от используемой метрики, 2) инструменты сборки, получившие хорошие оценки в одном виде, не обязательно хорошо работают в другом виде, и 3) сочетание различных подходов может быть наиболее надежным. [75] [76] [77]

Количественная оценка экспрессии генов Править

Экспрессия оценивается количественно для изучения клеточных изменений в ответ на внешние раздражители, различий между здоровым и болезненным состояниями и других исследовательских вопросов. Уровни транскрипции часто используются в качестве показателя изобилия белка, но они часто не эквивалентны из-за посттранскрипционных событий, таких как интерференция РНК и нонсенс-опосредованный распад. [78]

Выражение количественно оценивается путем подсчета числа считываний, отображаемых в каждом локусе на этапе сборки транскриптома. Экспрессию экзонов или генов можно количественно оценить с помощью контигов или аннотаций эталонных транскриптов. [8] Эти наблюдаемые подсчеты считывания RNA-Seq были тщательно проверены на соответствие более старым технологиям, включая экспрессионные микроматрицы и qPCR. [55] [79] Инструменты для количественной оценки - HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] и Cuffquant. Эти инструменты определяют количество считываний по выровненным данным RNA-Seq, но подсчеты без выравнивания можно также получить с помощью Sailfish [85] и Kallisto. [86] Счетчики чтения затем преобразуются в соответствующие показатели для проверки гипотез, регрессий и других анализов. Параметры для этого преобразования:

  • Глубина секвенирования / охват: Хотя глубина предварительно указывается при проведении нескольких экспериментов с RNA-Seq, она все равно будет сильно различаться между экспериментами. [87] Таким образом, общее количество считываний, сгенерированных в одном эксперименте, обычно нормализуется путем преобразования счетчиков во фрагменты, чтения или счета на миллион отображенных считываний (FPM, RPM или CPM). Разница между RPM и FPM исторически возникла в процессе эволюции от одностороннего секвенирования фрагментов к парному секвенированию. При одностороннем секвенировании существует только одно чтение на фрагмент (т.е., RPM = FPM). При секвенировании с парным концом выполняется два чтения на фрагмент (т.е., Об / мин = 2 x FPM). Глубину секвенирования иногда называют размером библиотеки, количеством промежуточных молекул кДНК в эксперименте.
  • Длина гена: Более длинные гены будут иметь больше фрагментов / считываний / отсчетов, чем более короткие гены, если экспрессия транскриптов одинакова. Это регулируется путем деления FPM на длину признака (который может быть геном, транскриптом или экзоном), в результате чего количество метрических фрагментов на килобазу признака на миллион отображенных считываний (FPKM). [88] При просмотре групп функций в выборках FPKM преобразуется в количество транскриптов на миллион (TPM) путем деления каждого FPKM на сумму FPKM в выборке. [89] [90] [91]
  • Общий выход образца РНК: Поскольку из каждого образца извлекается одинаковое количество РНК, образцы с большим количеством общей РНК будут иметь меньше РНК на ген. Эти гены, по-видимому, имеют пониженную экспрессию, что приводит к ложноположительным результатам в последующих анализах. [87] Стратегии нормализации, включая квантиль, DESeq2, TMM и Median Ratio, пытаются учесть это различие путем сравнения набора генов, экспрессируемых недифференциально, между выборками и соответствующего масштабирования. [92]
  • Дисперсия экспрессии каждого гена: моделируется для учета ошибки выборки (важно для генов с низким числом считываний), увеличения мощности и уменьшения количества ложных срабатываний. Дисперсия может быть оценена как нормальное, пуассоновское или отрицательное биномиальное распределение [93] [94] [95] и часто разлагается на техническую и биологическую дисперсию.

Всплески для абсолютной количественной оценки и обнаружения общегеномных эффектов Править

Добавки РНК - это образцы РНК в известных концентрациях, которые можно использовать в качестве золотых стандартов при планировании экспериментов и во время последующих анализов для абсолютной количественной оценки и выявления общегеномных эффектов.

  • Абсолютная количественная оценка: Абсолютная количественная оценка экспрессии генов невозможна в большинстве экспериментов с RNA-Seq, которые определяют количественную экспрессию относительно всех транскриптов. Это возможно путем выполнения RNA-Seq с добавлением образцов РНК в известных концентрациях. После секвенирования счетчики считываний всплесков последовательностей используются для определения взаимосвязи между счетчиками считываний каждого гена и абсолютными количествами биологических фрагментов [11] [96]. В одном примере этот метод использовался в Xenopus tropicalis эмбрионов для определения кинетики транскрипции. [97]
  • Обнаружение полногеномных эффектов: Изменения в глобальных регуляторах, включая ремоделирующие хроматин, факторы транскрипции (например, MYC), комплексы ацетилтрансфераз и расположение нуклеосом, не соответствуют предположениям о нормализации, и контрольные всплески могут предложить точную интерпретацию. [98] [99]

Дифференциальное выражение Править

Самое простое, но часто наиболее эффективное использование RNA-Seq - это обнаружение различий в экспрессии генов между двумя или более состояниями (например, лечить vs не лечить) этот процесс называется дифференциальным выражением. Выходы часто называют дифференциально экспрессируемыми генами (ДЭГ), и эти гены могут регулироваться либо с повышением, либо с понижением (т.е., выше или ниже в интересующем состоянии). Есть много инструментов, которые выполняют дифференциальное выражение. Большинство из них запускается в R, Python или командной строке Unix. Обычно используемые инструменты включают DESeq, [94] edgeR, [95] и voom + limma, [93] [100], все из которых доступны через R / Bioconductor. [101] [102] Вот общие соображения при выполнении дифференциального выражения:

  • Входы: Входные данные для дифференциальной экспрессии включают (1) матрицу экспрессии RNA-Seq (M генов x N образцов) и (2) матрицу дизайна, содержащую экспериментальные условия для N образцов. Простейшая матрица плана содержит один столбец, соответствующий меткам проверяемого условия. Другие ковариаты (также называемые факторами, функциями, метками или параметрами) могут включать пакетные эффекты, известные артефакты и любые метаданные, которые могут мешать или опосредовать экспрессию генов. В дополнение к известным ковариатам, неизвестные ковариаты также могут быть оценены с помощью подходов неконтролируемого машинного обучения, включая анализ главных компонентов, суррогатных переменных [103] и PEER [56]. Анализ скрытых переменных часто используется для данных RNA-Seq тканей человека, которые обычно содержат дополнительные артефакты, не зафиксированные в метаданных (например, время ишемии, источники из нескольких учреждений, основные клинические признаки, сбор данных за многие годы с большим количеством сотрудников).
  • Методы: Большинство инструментов используют регрессию или непараметрическую статистику для идентификации дифференциально экспрессируемых генов и основаны либо на подсчетах считываний, сопоставленных с эталонным геномом (DESeq2, limma, edgeR), либо на подсчетах считываний, полученных в результате количественной оценки без выравнивания (Sleuth, [104] ] Cuffdiff, [105] бальное платье [106]). [107] После регрессии большинство инструментов используют корректировку р-значения либо коэффициента ошибок на уровне семьи (FWER), либо коэффициента ложного обнаружения (FDR) для учета нескольких гипотез (в исследованиях на людях,

20000 генов, кодирующих белок, или

Последующий анализ списка дифференциально экспрессируемых генов бывает двух видов: подтверждение наблюдений и биологические выводы. Из-за ловушек дифференциальной экспрессии и RNA-Seq важные наблюдения воспроизводятся с помощью (1) ортогонального метода в тех же образцах (например, ПЦР в реальном времени) или (2) другого, иногда предварительно зарегистрированного, эксперимента в новой когорте. . Последнее помогает обеспечить обобщаемость и, как правило, может сопровождаться метаанализом всех объединенных когорт. Наиболее распространенным методом получения биологического понимания результатов более высокого уровня является анализ обогащения набора генов, хотя иногда используются подходы к генам-кандидатам. Обогащение набора генов определяет, является ли перекрытие между двумя наборами генов статистически значимым, в этом случае перекрытие между дифференциально экспрессируемыми генами и наборами генов из известных путей / баз данных (например, Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) или из дополнительных анализов тех же данных (например, сетей коэкспрессии). Общие инструменты для обогащения набора генов включают веб-интерфейсы (например, ENRICHR, g: profiler, WEBGESTALT) [114] и программные пакеты. При оценке результатов обогащения одна эвристика состоит в том, чтобы сначала искать обогащение известной биологии как проверку работоспособности, а затем расширять область поиска для поиска новой биологии.

Альтернативное сращивание Править

Сплайсинг РНК является неотъемлемой частью эукариот и вносит значительный вклад в регуляцию и разнообразие белков, происходя в> 90% генов человека. [115] Существует несколько альтернативных режимов сплайсинга: пропуск экзонов (наиболее распространенный способ сплайсинга у людей и высших эукариот), взаимоисключающие экзоны, альтернативные донорные или акцепторные сайты, удержание интронов (наиболее распространенный режим сплайсинга у растений, грибов и простейших), альтернативный сайт начала транскрипции (промотор) и альтернативное полиаденилирование. [115] Одна из целей RNA-Seq - выявить альтернативные события сплайсинга и проверить, различаются ли они в разных условиях. Секвенирование при длительном чтении фиксирует полный транскрипт и, таким образом, сводит к минимуму многие проблемы при оценке распространенности изоформ, такие как отображение неоднозначного чтения. Для коротко читаемой RNA-Seq существует несколько методов обнаружения альтернативного сплайсинга, которые можно разделить на три основные группы: [116] [89] [117]

  • На основе подсчета (также на основе событий, дифференциальное соединение): оценить удержание экзонов. Примеры: DEXSeq, [118] MATS, [119] и SeqGSEA. [120]
  • На основе изоформы (также модули с множественным чтением, дифференциальное выражение изоформы): сначала оцените численность изоформ, а затем относительную численность между условиями. Примерами являются Cufflinks 2 [121] и DiffSplice. [122]
  • На основе иссечения интрона: рассчитать альтернативное соединение с использованием разделенных чтений. Примеры: MAJIQ [123] и Leafcutter. [117]

Инструменты дифференциальной экспрессии генов также могут использоваться для дифференциальной экспрессии изоформ, если изоформы заранее определены количественно с помощью других инструментов, таких как RSEM. [124]

Сети коэкспрессии Править

Сети коэкспрессии - это основанные на данных представления генов, которые ведут себя одинаково в разных тканях и в экспериментальных условиях. [125] Их основная цель заключается в генерировании гипотез и подходах на основе ассоциации для определения функций ранее неизвестных генов. [125] Данные RNA-Seq были использованы для вывода генов, участвующих в определенных путях, на основе корреляции Пирсона как у растений [126], так и у млекопитающих. [127] Основным преимуществом данных RNA-Seq в этом виде анализа перед платформами микроматриц является возможность охвата всего транскриптома, что позволяет получить более полное представление о регуляторных сетях генов. Дифференциальная регуляция изоформ сплайсинга одного и того же гена может быть обнаружена и использована для прогнозирования их биологических функций. [128] [129] Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов успешно использовался для идентификации модулей коэкспрессии и внутримодульных хаб-генов на основе данных последовательности РНК. Модули коэкспрессии могут соответствовать типам клеток или путям. Высокосвязные внутримодульные концентраторы можно интерпретировать как представителей соответствующего модуля. Собственный ген - это взвешенная сумма экспрессии всех генов в модуле. Собственные гены - полезные биомаркеры (признаки) для диагностики и прогноза. [130] Были предложены подходы к преобразованию, стабилизирующим отклонения, для оценки коэффициентов корреляции на основе данных последовательности РНК. [126]

Вариант открытия Править

RNA-Seq фиксирует вариации ДНК, включая варианты с одним нуклеотидом, небольшие вставки / делеции. и структурные вариации. Вызов вариантов в RNA-Seq аналогичен вызову вариантов ДНК и часто использует те же инструменты (включая SAMtools mpileup [131] и GATK HaplotypeCaller [132]) с настройками для учета сплайсинга. Одним из уникальных параметров для вариантов РНК является аллель-специфическая экспрессия (ASE): варианты только одного гаплотипа могут предпочтительно экспрессироваться из-за регуляторных эффектов, включая импринтинг и экспрессию локусов количественных признаков, а также некодирующие редкие варианты. [133] [134] Ограничения идентификации варианта РНК включают то, что он отражает только экспрессируемые области (у людей, <5% генома), может быть предметом систематических ошибок, вносимых обработкой данных (например, сборки транскриптомов de novo недооценивают гетерозиготность [135] ) и имеет более низкое качество по сравнению с прямым секвенированием ДНК.

Редактирование РНК (посттранскрипционные изменения) Править

Наличие совпадающих геномных и транскриптомных последовательностей человека может помочь обнаружить посттранскрипционные изменения (редактирование РНК). [3] Событие посттранскрипционной модификации идентифицируется, если транскрипт гена имеет аллель / вариант, не обнаруженный в геномных данных.

Обнаружение слитного гена Править

Вызванные различными структурными модификациями в геноме, гибридные гены привлекли внимание из-за их связи с раком. [136] Способность RNA-Seq беспристрастно анализировать весь транскриптом образца делает его привлекательным инструментом для поиска таких общих явлений при раке. [4]

Идея вытекает из процесса выравнивания коротких транскриптомных чтений с эталонным геномом. Большинство коротких прочтений попадают в один полный экзон, и ожидается, что меньший, но все же большой набор будет отображаться на известные экзон-экзонные соединения. Оставшиеся неотмеченные короткие считывания затем будут дополнительно проанализированы, чтобы определить, соответствуют ли они переходу экзон-экзон, где экзоны происходят от разных генов. Это свидетельствовало бы о возможном событии слияния, однако из-за продолжительности считывания это могло оказаться очень шумным. Альтернативный подход состоит в использовании чтения с парного конца, когда потенциально большое количество парных чтений будет сопоставлять каждый конец с разным экзоном, обеспечивая лучшее покрытие этих событий (см. Рисунок). Тем не менее, конечный результат состоит из множества и потенциально новых комбинаций генов, обеспечивающих идеальную отправную точку для дальнейшей проверки.

RNA-Seq была впервые разработана в середине 2000-х годов с появлением технологии секвенирования следующего поколения. [139] Первые рукописи, которые использовали RNA-Seq даже без использования этого термина, включают рукописи клеточных линий рака простаты [140] (датированные 2006 годом), Medicago truncatula [141] (2006 г.), кукуруза [142] (2007 г.) и Arabidopsis thaliana [143] (2007), в то время как сам термин «RNA-Seq» впервые был упомянут в 2008 г. [144] Количество рукописей, относящихся к RNA-Seq в названии или аннотации (рисунок, синяя линия), постоянно увеличивается с 6754 рукописями. опубликовано в 2018 году. Пересечение RNA-Seq и медицины (рисунок, золотая линия) имеет аналогичную скорость. [145]

Приложения к медицине Править

RNA-Seq имеет потенциал для выявления новой биологии болезни, профильных биомаркеров для клинических показаний, определения путей воздействия лекарств и постановки генетического диагноза. Эти результаты могут быть дополнительно персонализированы для подгрупп или даже отдельных пациентов, потенциально подчеркивая более эффективную профилактику, диагностику и терапию. Осуществимость этого подхода частично диктуется затратами в деньгах и времени; связанное с этим ограничение - необходимая группа специалистов (биоинформатики, врачи / клиницисты, базовые исследователи, техники) для полной интерпретации огромного количества данных, полученных в результате этого анализа. [146]

Масштабные усилия по секвенированию Править

Большое внимание было уделено данным РНК-Seq после того, как проекты Энциклопедии элементов ДНК (ENCODE) и Атлас генома рака (TCGA) использовали этот подход для характеристики десятков клеточных линий [147] и тысяч первичных образцов опухолей, [148] соответственно. ENCODE нацелен на идентификацию общегеномных регуляторных областей в различных когортах клеточных линий, и транскриптомные данные имеют первостепенное значение для понимания нисходящего эффекта этих эпигенетических и генетических регуляторных слоев. TCGA, напротив, был нацелен на сбор и анализ тысяч образцов пациентов из 30 различных типов опухолей, чтобы понять основные механизмы злокачественной трансформации и прогрессирования. В этом контексте данные RNA-Seq предоставляют уникальный снимок транскриптомного статуса заболевания и позволяют рассматривать беспристрастную популяцию транскриптов, что позволяет идентифицировать новые транскрипты, гибридные транскрипты и некодирующие РНК, которые можно было бы не обнаружить с помощью различных технологий.

Эта статья была отправлена ​​в ВикиЖурнал науки для внешней академической экспертной оценки в 2019 году (отчеты рецензентов). Обновленный контент был повторно интегрирован на страницу Википедии по лицензии CC-BY-SA-3.0 (2021 г.). Рассматриваемая версия записи: Felix Richter et al. (17 мая 2021 г.). «Широкое введение в RNA-Seq». ВикиЖурнал науки. 4 (2): 4. DOI: 10.15347 / WJS / 2021.004. ISSN 2470-6345. Викиданные Q100146647.


Лечение бактериальных и вирусных инфекций

Открытие антибиотиков от бактериальных инфекций считается одним из самых важных достижений в истории болезни. К сожалению, бактерии очень легко приспосабливаются, и чрезмерное использование антибиотиков сделало многие из них устойчивыми к антибиотикам. Это создало серьезные проблемы, особенно в больницах.

Антибиотики не эффективны против вирусов, и многие ведущие организации теперь рекомендуют не использовать антибиотики, если нет явных доказательств бактериальной инфекции.

С начала 20 века разрабатываются вакцины. Вакцины резко снизили количество новых случаев вирусных заболеваний, таких как полиомиелит, корь и ветряная оспа. Кроме того, вакцины могут предотвратить такие инфекции, как грипп, гепатит А, гепатит В, вирус папилломы человека (ВПЧ) и другие.

Но лечение вирусных инфекций оказалось более сложной задачей, прежде всего потому, что вирусы относительно крошечные и размножаются внутри клеток. Для лечения некоторых вирусных заболеваний, таких как инфекции, вызванные вирусом простого герпеса, ВИЧ / СПИД и грипп, стали доступны противовирусные препараты. Но использование противовирусных препаратов было связано с развитием устойчивых к лекарствам микробов.

Источники

Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний: «Понимание микробов при болезнях и здоровье».

MicrobeWorld.org: «Вирус или бактерия?» «Вирусное или бактериальное размножение».

Руководство Merck Second Home Edition: «Бактериальные инфекции», «Вирусные инфекции».


Одноцепочечные вирусы демонстрируют более высокую частоту мутаций, чем двухцепочечные вирусы.

Вирусы с одноцепочечной ДНК, как правило, мутируют быстрее, чем вирусы с двухцепочечной ДНК, хотя это различие основано на работе с бактериофагами, поскольку для эукариотических вирусов с одноцепочечной ДНК не было получено оценок скорости мутаций [1]. Внутри РНК-вирусов нет очевидных различий в частоте мутаций между классами Балтимора (рис. & # X000a0 2 a). Механизмы, лежащие в основе этих различий, не совсем понятны. Одно из возможных объяснений различий между одноцепочечными и двухцепочечными вирусами состоит в том, что одноцепочечные нуклеиновые кислоты более склонны к окислительному дезаминированию и другим типам химического повреждения. Повышенные уровни активных форм кислорода (АФК) и других клеточных метаболитов во время вирусных инфекций могут вызывать мутации в клетке-хозяине и в вирусе. Например, этанол, вероятно, будет действовать синергетически с вызванным вирусом окислительным стрессом, увеличивая скорость мутации ВГС [21]. Различия между одноцепочечными и двухцепочечными вирусами ДНК также можно объяснить их доступом к пострепликативной репарации. Работа с бактериофагом & # x003d5X174 дала интересные подсказки по этому поводу. У энтеробактерий репарация ошибочного спаривания, направленная на метил (MMR), осуществляется белками MutHLS и метилазой Dam. Dam метилирование мотивов последовательности GATC используется для дифференциации матричных и дочерних цепей ДНК и, таким образом, необходимо для выполнения коррекции несоответствия [22]. Несоответствия распознаются MutS, который взаимодействует с MutL и приводит к активации эндонуклеазы MutH, которая иссекает дочернюю цепь. Однако геном бактериофага & # x003d5X174 не имеет мотивов последовательности GATC, даже если случайно ожидается около 20 таких сайтов. В результате ДНК & # x003d5X174 не может пройти MMR. Это объясняет относительно высокую частоту мутаций этого вируса, которая составляет порядка 10 & # x022126 & # x000a0s / n / c, что на три порядка выше, чем у кишечная палочка и самый высокий среди ДНК-вирусов [23]. Избегание мотивов GATC может быть следствием отбора, воздействующего на скорость мутаций, а также других факторов отбора. Например, неэффективное метилирование ДНК фага может сделать ее восприимчивой к расщеплению с помощью MutH, тем самым создавая давление отбора против мотивов последовательности GATC [24].

В отличие от бактериофага & # x003d5X174, связь между пострепликативной репарацией и скоростью мутации у эукариотических вирусов все еще неясна. Многочисленные исследования показали, что вирусы взаимодействуют с путями ответа на повреждение ДНК (DDR), изменяя локализацию или способствуя деградации компонентов DDR [25, 26]. Например, аденовирусный белок E4orf6 способствует протеасомной деградации TOPBP1, компонента DDR [27]. Активация DDR может происходить как косвенное следствие клеточного стресса из-за инфекции как таковой или как часть противовирусного ответа, которому, в свою очередь, противодействуют вирусы. Хотя ДНК-вирусы имеют тенденцию способствовать геномной нестабильности в клетке-хозяине, еще предстоит показать, может ли нарушение регуляции DDR определять скорость мутаций ДНК-вируса.


Вирусы с положительной цепью РНК представляют собой самую большую группу РНК-вирусов, насчитывающую 30 семейств.

ЦЕЛИ ОБУЧЕНИЯ

Классифицируйте характеристики вирусов с положительной цепью

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

Ключевые моменты

  • Нуклеиновая кислота обычно представляет собой одноцепочечную РНК (оцРНК), но может быть двухцепочечной РНК (дцРНК).
  • РНК-вирус - это вирус, генетическим материалом которого является РНК (рибонуклеиновая кислота).
  • Известные заболевания человека, вызываемые РНК-вирусами, включают атипичную пневмонию, грипп, гепатит С, лихорадку Западного Нила и полиомиелит.

Ключевые термины

  • вирус: Субмикроскопический инфекционный организм, который теперь понимается как неклеточная структура, состоящая из ядра ДНК или РНК, окруженного белковой оболочкой. Для размножения требуется живая клетка, что часто вызывает заболевание в организме-хозяине.
  • генетический: Относится к генетике или генам.
  • РНК: Рибонуклеиновая кислота (РНК) - это повсеместное семейство больших биологических молекул, которые выполняют множество жизненно важных ролей в кодировании, декодировании, регуляции и экспрессии генов.

Вирусы с одноцепочечной РНК можно классифицировать в соответствии с смыслом или полярностью их РНК на вирусы с отрицательной и положительной или амбисенсорной РНК. Положительно-смысловая вирусная РНК подобна мРНК и, таким образом, может немедленно транслироваться клеткой-хозяином. Вирусная РНК с отрицательным смыслом комплементарна мРНК и, таким образом, должна быть преобразована в РНК с положительным смыслом с помощью РНК-полимеразы перед трансляцией. Таким образом, очищенная РНК вируса с положительным смыслом может напрямую вызывать инфекцию, хотя она может быть менее заразной, чем целая вирусная частица. Очищенная РНК вируса с отрицательным смыслом не является инфекционной сама по себе, поскольку ее необходимо транскрибировать в РНК с положительным смыслом. Каждый вирион можно транскрибировать в несколько РНК с положительным смыслом. Вирусы с РНК Ambisense напоминают вирусы с РНК с отрицательным смыслом, за исключением того, что они также транслируют гены с положительной цепи. Наиболее распространенными вирусными РНК-вирусами с положительной цепью, которые инфицируют людей, являются пикорнавирусы.

Фигура: Болезнь стопы и рта: Ящур вызывается вирусом Aphthovirus, который имеет положительную цепь РНК вируса семейства Picornaviridae вирусов животных.

Пикорнавирус - это вирус, принадлежащий к семейству Picornaviridae. Пикорнавирусы - это вирусы с положительной цепью РНК без оболочки с икосаэдрическим капсидом. Геномная РНК необычна, потому что она имеет белок на 5 & Prime конце, который используется в качестве праймера для транскрипции РНК-полимеразой. Название происходит от слова «пико», что означает «маленький», и «РНК», относящегося к геному рибонуклеиновой кислоты, так что «ldquopicornavirus» буквально означает вирус с малой РНК. Пикорнавирусы делятся на несколько родов и включают множество важных патогенов человека и животных. Болезни, которые они вызывают, разнообразны: от острых заболеваний, похожих на простуду, до полиомиелита и хронических инфекций домашнего скота. Дополнительные виды, не принадлежащие ни к одному из признанных родов, продолжают описываться.


Вакцина против вируса папилломы человека

Донателла Панатто,. Роберто Гаспарини, в достижениях в химии белков и структурной биологии, 2015 г.

3 Протеом

Геном ВПЧ окружен сферическим икосаэдрическим капсидом (Т = 7 симметрии), состоящий из двух структурных белков L1 и L2.

Вирусный геном, как уже упоминалось в предыдущем абзаце, можно условно разделить на три части: первая часть состоит примерно из двух третей генома и кодирует ранние белки, вторая часть - примерно треть ВПЧ. геном, кодирует поздние структурные белки, тогда как третья часть в основном не кодирует и включает элементы и мотивы, важные для репликации и транскрипции (Campo & amp Roden, 2010 Malik, Khan, & amp Ahsan, 2014).

Доступные структуры, основные функции и известные взаимодействующие партнеры белков HPV просматриваются в таблицах 6, 7 и 8 соответственно.

Таблица 6. Доступные структуры белков вируса папилломы человека, депонированные в банке данных о белках

Белок ВПЧТип ВПЧИспользуемый метод определения структурыМолекулярные деталиразрешениеСтруктуры PDB
L116рентгеновский снимокСтруктура мелких вирусоподобных частиц, собранных из белка L1 вируса папилломы человека 163.50 1DZL
16рентгеновский снимокПентамерная структура основного капсидного белка L1 вируса папилломы человека 16 типа3.70 2R5H
18рентгеновский снимокПентамерная структура основного капсидного белка L1 вируса папилломы человека 18 типа3.40 2R5I
35рентгеновский снимокПентамерная структура основного капсидного белка L1 вируса папилломы человека 35 типа3.30 2R5J
11рентгеновский снимокПентамерная структура основного капсидного белка L1 вируса папилломы человека 11 типа3.20 2R5K
16Электронная микроскопияЭлектронная криомикроскопия капсида вируса папилломы человека 16 типа9.10 3J6R
16Электронная микроскопияЭлектронная криомикроскопия Fab-фрагментов вируса папилломы человека 16 и H16.V513.60 3J7G
16рентгеновский снимокКристаллическая структура пентамера L1 HPV-16, связанного с олигосахаридами гепарина2.80 3OAE
18рентгеновский снимокКристаллическая структура пентамеров L1 капсида вируса папилломы 18 человека (HPV-18), связанных с олигосахаридами гепарина3.40 3OFL
L218рентгеновский снимокДНК-связывающий домен E2 вируса папилломы человека 18 типа, связанный с его ДНК-мишенью2.40 1JJ4
E118рентгеновский снимокКристаллическая структура ДНК-связывающего домена белка инициации репликации вируса папилломы человека 18 типа (HPV-18) E11.80 1R9W
18рентгеновский снимокРентгеновская структура геликазы вируса папилломы в комплексе с ее молекулярным свастателем E22.10 1TUE
E231рентгеновский снимокКристаллическая структура ДНК-связывающего домена Е2 вируса папилломы человека при 2,4 Å2.4 1A7G
18рентгеновский снимокКристаллическая структура ДНК-связывающего домена Е2 ВПЧ-182.20 1BY9
31ЯМРДНК-связывающий домен E2 из вируса папилломы человека 31 типа, ЯМР, минимизированная средняя структура 1DHM
16рентгеновский снимокКристаллическая структура полного домена трансактивации белка E2 из вируса папилломы человека 16 типа1.90 1DTO
18рентгеновский снимокКристаллическая структура ДНК-связывающего домена Е2 ВПЧ-181.90 1F9F
18рентгеновский снимокДНК-связывающий домен E2 вируса папилломы человека 18 типа, связанный с его ДНК-мишенью2.40 1JJ4
11рентгеновский снимокКристаллическая структура HPV-11 E2 TAD2.50 1R6K
11рентгеновский снимокКомплексная кристаллическая структура HPV-11 E2 TAD2.40 1R6N
6 и 16рентгеновский снимокСравнение структуры и ДНК-связывающих свойств белков E2 онкогенного и неонкогенного вируса папилломы человека1.90 1R8H
16ЯМРСтруктура раствора ДНК-связывающего домена Е2 ВПЧ-16, регулятора транскрипции с димерной бета-ствольной складкой 1R8P
18рентгеновский снимокРентгеновская структура геликазы вируса папилломы в комплексе с ее молекулярным свастателем E22.10 1TUE
E616ЯМРСтруктура раствора С-концевого цинк-связывающего домена онкобелка Е6 ВПЧ-16 2FK4
18рентгеновский снимокРентгеновская кристаллическая структура Sap97 PDZ3, связанного с C-концевым пептидом E6 HPV-182.80 2I0I
16ЯМРСтруктура мономерного N-концевого домена онкобелка Е6 ВПЧ-16 2LJX
16ЯМРМодель Пикши димера N-концевого домена E6 HPV-16 2LJY
16ЯМРСтруктура С-концевого домена онкобелка Е6 ВПЧ-16 2LJZ
51ЯМРСтруктура раствора комплекса, состоящего из остатков 318–406 hDlg / SAP-97 и остатков 141–151 онкобелка E6 ВПЧ-51 2М3М
18ЯМРСтруктура hDLG / SAP97 PDZ2 в комплексе с пептидом E6 папилломавируса HPV-18 2OQS
16рентгеновский снимокКристаллическая структура полноразмерного онкопротеина E6 вируса папилломы человека в комплексе с пептидом LXXLL убиквитинлигазы E6AP с разрешением 2,55 Å2.55 4GIZ
E716рентгеновский снимокКарман RB, привязанный к мотиву E7 LXCXE.1.85 1GUX
1рентгеновский снимокКристаллическая структура домена CR3 E7 HPV1.60 2B9D
45ЯМРСтруктура раствора С-концевого домена (мономера) онкобелка Е7 ВПЧ-45 2EWL
45ЯМРСтруктура ЯМР С-концевого домена (димера) онкобелка Е7 ВПЧ-45 2F8B
рентгеновский снимокКарманный домен p107 в комплексе с пептидом Е7 ВПЧ2.24 4ЛЕТ

Сокращение: ЯМР, ядерный магнитный резонанс.

Адаптировано из PAVE (http://pave.niaid.nih.gov/) и обновлено из Protein DataBank (http://www.rcsb.org/pdb) и из банка данных биологического магнитного резонанса (http: // www. bmrb.wisc.edu/).

Таблица 7. Функциональные характеристики белков вируса папилломы человека

Белок ВПЧФункциональные роли
L1Основной белок капсида
L2Незначительный капсидный белок
Вирусный трафик
Инкапсидация вирусной ДНК
Выпуск вириона
Подавление созревания клеток Langherans
E1Репликация вирусного генома
E2 (полная длина)Комплекс распознавания вирусного происхождения (ORC)
Взаимодействие с E1 и репликация ДНК
Гомодимеризация и связывание ДНК
Взаимодействие с хроматином через Brd4 и другие комплексы
Регуляция и модуляция транскрипции
Сегрегация генома и поддержание плазмиды / хромосомы через SMC5 / 6
Контроль активности и обработки РНК
Контроль клеточного цикла (остановка G1) посредством ингибирования E6 и E7 и повторной активации путей p53 и Rb
Контроль апоптоза с помощью каспазы 8
Индукция анеуплоидии и некоторых частичных трансформирующих свойств (через пути TNF-α / STAT3 / NF-κB)
E2 (усеченная форма)Подавление транскрипции и репликации
E3Неизвестная функция
E4 / E1ˆE4Сборка вирусов
Вирусный релиз
Формирование центров репликации вирусов
Экспрессия капсидного белка
Продуктивные вирусные инфекции (маркер острой фазы)
Модуляция клеточного цикла (остановка G2)
Амплификация вирусного генома
Вирусная передача
Коллапс цитоскелета
Вмешательство в метаболизм РНК
Вмешательство в синтез ДНК
Индукция апоптоза
E5Вмешательство в деятельность щелевых соединений
Нарушение функции вакуолярной АТФазы
Нарушение эндосомного закисления
Иммуноэскейп (вмешательство в экспрессию антигенов гистосовместимости)
Модуляция состава и биофизических свойств клеточных мембран
Вмешательство в пути EGF / EGFR
Неопластическое начало
Подавление апоптоза
Эпителиально-мезенхимальный переход
E6Взаимодействие онкобелка с p53
Расщепление белка через E6AP или через EDD1
Иммуноэскейп (подавление молекул адгезии)
Апоптоз
Подавление дифференцировки клеток
Хромосомная нестабильность
Потеря полярности клеток
Индукция гиперплазии
Эпителиально-мезенхимальный переход
Вторжение
E7Взаимодействие онкобелка с белком pRb и карманными белками (p107 и p130)
Деградация белков
Хромосомная и геномная нестабильность из-за активации ATM, ATR и гамма-тубулина, что приводит к ошибкам сегрегации хромосом и аберрантному синтезу ДНК.
Задержка восстановления ДНК
Дестабилизация центромер
Клеточный цикл (фаза G1 / S) и вмешательство в контрольные точки сотовой связи
Индукция аберрантного митоза (например, псевдобиполярного, триполярного и мультиполярного митоза)
Нарушение клеточного метаболизма и митохондриального дыхания
Репликация вирусного генома и транскрипция вирусного гена
Ремоделирование хроматина, эпигенетическое перепрограммирование и метилирование промотора
Гибель клеток и апоптоз
Индукция гиперплазии
Передача сигналов цитокинов
Иммуноэскейп (подавление молекул адгезии и вмешательство в основной путь класса I комплекса гистосовместимости)
Эпителиально-мезенхимальный переход
Миграция клеток рака шейки матки
Вторжение
E8ˆE2CПодавление экспрессии ранних генов

Таблица 8. Известные партнеры по взаимодействию белков вируса папилломы человека

Белок ВПЧИзвестные целевые белки
E1 а E2
Компоненты репарации ДНК (ATM, Chk2, p53)
Конъюгирующие ферменты (CK2, UBE2I / Ubc9)
Ремоделирование хроматина (SMARCB1, гистон H1, Ini1 / hSNF5)
Компоненты репликации ДНК (субъединицы p70, p180 комплекса ДНК-полимеразы альфа-примазы, RPA, Topo1, E1BP / TRIP13, комплексы деубиквитинирующих ферментов, такие как p80 / UAF1, USP1, USP12, USP46)
Факторы / коактиваторы транскрипции (ТАТА-связывающие белки (ТВР))
Шапероны (Hsp40, Hsp70)
Клеточный цикл (Cdk2, Cyclin A / E, ERK1, JNK2)
Иммунная регуляция (IFIT1, интерферон-индуцибельный фактор или p56)
Контроль апоптоза (каспаза 3, каспаза 7)
Экспортины (Crm1)
E2 b E1
L1
Компоненты ядерного матрикса (MATR3, HNRNPU, HNRNPA1 PTM CSNK2A1, CSNK2A2, CSNK2B SRPK1 / 2 PRMT5 PPP2CA / CB / R1A, BAZ1B, KPNA3)
Компоненты репликации / репарации ДНК (TOP1 / Topo1, TopBP1, ATM, Chk2, p53, p70, RFC2, RFC3, RFC4, RFC5, ATAD5, PARP, RPA1 / RPA-70, WICH — BAZ1B, SMARCA5)
Факторы / коактиваторы транскрипции (AMF1 / GPS2, BNC2, YY1, TMF1, HoxC9, NR4A1, SP1, CEBPA, CEBPB, GTF2B, TRIM28, NAP1, TATA-связывающие белки (TBP) и связанные с TBP факторы, такие как комплекс TFIIB —TAF1 / TFIID / p250, TAF6 / TAFII70 / 80, TAF7 / TAFII55)
Факторы сплайсинга, обрабатывающие РНК (C1QBP, SNRNP70, SRSF1, SRSF4, SRSF5, CPSF4 / CPSF30, TRA2B)
Структурные белки хромосомы (SMC5 / 6)
Ацетилазы гистонов (pCAF / KAT2B, p300, CBP, TTRAP / TIP60 — INO80, p400, TRRAP)
Гистоновые деацетилазы (NCOR1, HDAC, SAP18)
Гистоновые деметилазы (KDM1B)
Гистон-метилтрансфераза (SETDB1, WDR5, WHSC-WHSC1 / WHSCL1, SALL4-PRMT5, EHMT1), связывание с хроматином (BRD4, P-TEFb, Polycomb E2F6, PCGF6, RNF2)
Ремоделирование хроматина (JARID1C / SMCX / KDM5C, NAP1L1 / NAP1, SWI / SNF — SMARCA4 — MI-2 / NuRD — CHD4, SMARCA5, HDAC1, HDAC2, HDAC3, MTA1, MTA2 — WICH — BAZ1B, SMARCA80 — INAPO80 — INAPO80 — INAPO80 — TRIPO80 — TRAPCA5 , p400, TRRAP)
контроль клеточного цикла (SKP2, SAC, MCC — Cdc20, MAD2, BUBR1)
контроль апотптиса (CASP8 / FLICE и другие компоненты пути каспазы 8, такие как CFLAR / cFLIP)
Конъюгирующие ферменты (CK2, UBC9 / UBE2I)
Эндосомные / лизосомальные белки (VPS39)
Белки, связанные с эндоцитозом (CLTA)
Метаболизм (GRIP1)
Неизвестно (CCHCR1)
E4 / E1ˆE4 / усеченный E4СРПК1
Компоненты цитокератиновой матрицы
Белки клеточной полярности (Dlg1, PATJ и ZO-2)
E5E6
E7
Пути EGF / EGR (EGFR)
Пути PDGF / PDGFR (PDGFR)
Контроль клеточного цикла (белки контрольной точки веретена или SCP, Bub1, Mad2 и различные киназы MAP)
Эндосомное закисление (субъединица 16 кДа вакуолярной Н + -АТФазы)
Регуляция иммунного ответа (HLA-A)
Факторы транскрипции (TRIP-Br1)
Неизвестно (YIPF4, Bap31)
E6 c E5
E7
Путь p53 (p53, CBP / p300)
Регуляция иммунного ответа (IRF3, Tyk2)
Ремоделирование цитоскелета (паксиллин)
Компоненты ядерной матрицы (SMAR1)
Белки PDZ (hDlg, hScrb, MUPP1, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3)
Контроль апоптоза (Бак, ПКН)
Комплекс деградации (E6AP, E6TP1, hADA3)
Факторы транскрипции (c-fos, c-myc, IRF3, GPS2, NFX123)
Компоненты каспазного пути (каспаза 2, 3, 7, 8, 9, BCl2, IAP2, сурвивин, факторы, вызывающие апоптоз (AIF))
Компоненты репарации ДНК (ATR, BARD1, BRCA1)
Клеточный цикл (E6BP, MMP7, Tyk2, Ras, Raf, p16INK4a, hTERT)
Неизвестная функция (E6BP / Erc55)
E7E5
E6
RB1, RBL1 (p107), RBL2 (p130)
Контроль клеточного цикла (p21 / WAF1CIP1, p27 / KIP1, CyclinA, CyclinE, Cdk2, киназа гистона H1, комплекс NuMA)
Компоненты репарации ДНК (p48)
вмешательство в метаболизм (M2-PK, альфа-глюкозидаза, IGFBP-3)
Активаторы транскрипции (AP1, Forkhead MPP2, TATA-связывающие белки (TBP))
Компоненты репарации ДНК (ATM, BRCA1, BRCA2, FANCD2)
Ремоделирование хроматина (HDAC1, HDAC2, Mi2)
Субъединица S4 протеасомы
Контроль апоптоза (каспаза 3, 7, 9 и другие компоненты каспазного пути, Siva-1)
L1E2
L2
Гепарансульфат, ламинин-5, ламинин-332
Циклофилины
Ядерный транспорт (импортины / транспортны-подобные TNPO1, IPO5, KPNA2, KPNB1)
L2 d E2
L1
До поступления (Фурин, альфа-дефенсин HD5, циклофилин B, аннексин A2)
Везикулярный трафик и выход из эндосом (циклофилин B, гамма-секретаза, SNX17, SNX27, TSG101)
Ядерный транспорт (Syntaxin 18, Hsc70, Beta-Actin, моторные белки Dynein, такие как DYNLT1, импортины / транспортины DYNLT3, такие как TNPO1, IPO5, KPNA2, KPNB1)
Конъюгирующие ферменты (SUMO)
Сборка вириона (ND10, TBX2, TBX3)
Неизвестно (PATZ, TIP60, TIN-AG-RP, PLINP)

Обычно вирусный геном существует в виде эписомы, синхронно реплицирующейся с ДНК клетки-хозяина. Однако при злокачественных новообразованиях вирусная ДНК интегрируется в геном хозяина, активируя пути и каскады, которые приводят к дальнейшему прогрессированию рака. Жизненный цикл вируса завершается упаковкой вирусного генома и высвобождением вируса, что включает рекрутирование L2, опосредованного E2, и активную роль L2 в репликации, экспрессию L1 и сборку капсида (Nguyen, Ramírez-Fort , & amp Rady, 2014).


Биология 171


Вирусы - это неклеточные паразитические образования, которые нельзя отнести к какому-либо царству. Они могут заражать такие разнообразные организмы, как бактерии, растения и животные. Фактически, вирусы существуют в своего рода преисподней между живым организмом и неживым существом. Живые существа растут, метаболизируются и размножаются. Напротив, вирусы не являются клеточными, не имеют метаболизма или роста и не могут делиться путем деления клеток. Вирусы жестяная банка копировать или реплицировать себя, однако они полностью зависят от ресурсов, полученных из их клеток-хозяев, для производства потомства вирусов, которые собираются в своей зрелой форме. Никто точно не знает, когда и как произошли вирусы или из какого источника, потому что вирусы не оставили летописи окаменелостей. Некоторые вирусологи утверждают, что современные вирусы представляют собой мозаику кусочков нуклеиновых кислот, взятых из различных источников на соответствующих эволюционных путях.

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете делать следующее:

  • Опишите, как были впервые обнаружены вирусы и как они обнаруживаются.
  • Обсудите три гипотезы о том, как эволюционировали вирусы.
  • Опишите общую структуру вируса.
  • Распознавать основные формы вирусов
  • Понимать прошлые и новые системы классификации вирусов
  • Опишите основы системы классификации Балтимора.

Вирусы - это разные сущности: они различаются по структуре, способам репликации и хостам, которые они заражают. Почти все формы жизни - от прокариотических бактерий и архей до эукариот, таких как растения, животные и грибы, - имеют вирусы, которые их заражают. Хотя большую часть биологического разнообразия можно понять через историю эволюции (например, как виды адаптировались к изменяющимся условиям окружающей среды и как разные виды связаны друг с другом общим происхождением), многое о происхождении и эволюции вирусов остается неизвестным.

Открытие и обнаружение

Вирусы были впервые обнаружены после разработки фарфорового фильтра - фильтра Чемберленда-Пастера - который мог удалить все бактерии, видимые в микроскоп, из любого жидкого образца. В 1886 году Адольф Мейер продемонстрировал, что болезнь табачных растений - болезнь табачной мозаики - может передаваться от больного растения к здоровому через жидкие растительные экстракты. В 1892 году Дмитрий Ивановский показал, что эта болезнь может передаваться таким образом даже после того, как фильтр Чемберленда-Пастера удалил из экстракта все жизнеспособные бактерии. Тем не менее, прошло много лет, прежде чем было доказано, что эти «фильтруемые» инфекционные агенты были не просто очень маленькими бактериями, а новым типом очень маленьких, вызывающих болезни частиц.

Большинство вирионов или отдельных вирусных частиц очень малы, примерно от 20 до 250 нанометров в диаметре. Однако некоторые недавно обнаруженные вирусы амеб имеют диаметр до 1000 нм. За исключением крупных вирусов, таких как поксвирус и другие крупные ДНК-вирусы, вирусы невозможно увидеть в световой микроскоп. Только после разработки электронного микроскопа в конце 1930-х годов ученые впервые получили хорошее представление о структуре вируса табачной мозаики (TMV) ((Рисунок)), обсуждаемого выше, и других вирусов ((Рисунок)). Структуру поверхности вирионов можно наблюдать с помощью сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии, в то время как внутренние структуры вируса можно наблюдать только на изображениях с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Использование электронной микроскопии и других технологий позволило открыть множество вирусов всех типов живых организмов.


Эволюция вирусов

Хотя биологи обладают значительным объемом знаний о том, как современные вирусы мутируют и адаптируются, гораздо меньше известно о том, как вирусы возникли в первую очередь. Изучая историю эволюции большинства организмов, ученые могут взглянуть на летописи окаменелостей и аналогичные исторические свидетельства. Однако, насколько нам известно, вирусы не окаменели, поэтому исследователи должны экстраполировать результаты исследований эволюции современных вирусов и использовать биохимическую и генетическую информацию для создания спекулятивных историй вирусов.

Большинство ученых согласны с тем, что у вирусов нет единого общего предка, и нет единой разумной гипотезы о происхождении вирусов. Существуют текущие эволюционные сценарии, которые могут объяснить происхождение вирусов. Одна из таких гипотез, «деволюция» или регрессивная гипотеза, предполагает, что вирусы произошли от свободноживущих клеток или от внутриклеточных прокариотических паразитов. Однако многие компоненты того, как мог происходить этот процесс, остаются загадкой. Вторая гипотеза, беглец или беглец. прогрессивная гипотеза, предполагает, что вирусы произошли от молекул РНК и ДНК, которые вышли из клетки-хозяина. Третья гипотеза. самовоспроизводящаяся гипотеза, предполагает, что вирусы могли происходить от самовоспроизводящихся объектов, подобных транспозонам или другим мобильным генетическим элементам. Во всех случаях вирусы, вероятно, продолжают развиваться вместе с клетками, на которые они полагаются в качестве хозяев.

По мере развития технологий ученые могут разрабатывать и уточнять дополнительные гипотезы, объясняющие происхождение вирусов. Возникающая область, называемая молекулярной систематикой вирусов, пытается сделать это путем сравнения секвенированного генетического материала. Эти исследователи надеются, что однажды они лучше поймут происхождение вирусов - открытие, которое может привести к успехам в лечении вызываемых ими недугов.

Вирусная морфология

Вирусы не являются клеточными, то есть являются биологическими объектами, не имеющими клеточной структуры. Поэтому им не хватает большинства компонентов клетки, таких как органеллы, рибосомы и плазматическая мембрана. Вирион состоит из ядра нуклеиновой кислоты, внешнего белкового покрытия или капсида, а иногда и внешней оболочки, состоящей из белков и фосфолипидных мембран, полученных из клетки-хозяина. Вирусы также могут содержать дополнительные белки, такие как ферменты, внутри капсида или прикрепленные к вирусному геному. Наиболее очевидное различие между членами разных вирусных семейств - это различия в их морфологии, которая весьма разнообразна. Интересной особенностью сложности вируса является то, что сложность хозяина не обязательно коррелирует со сложностью вириона. Фактически, одни из самых сложных структур вирионов обнаруживаются в бактериофагах - вирусах, заражающих простейшие живые организмы, бактерии.

Морфология

Вирусы бывают разных форм и размеров, но эти особенности одинаковы для каждого вирусного семейства. Как мы видели, все вирионы имеют геном нуклеиновой кислоты, покрытый защитным капсидом. Белки капсида закодированы в вирусном геноме и называются капсомеры . Некоторые вирусные капсиды представляют собой простые спирали или многогранные «сферы», тогда как другие имеют довольно сложную структуру ((рисунок)).


В целом капсиды вирусов подразделяются на четыре группы: спиральные, икосаэдрические, оболочечные и головные и хвостовые. Спиральные капсиды бывают длинными и цилиндрическими. Многие вирусы растений спиралевидные, включая TMV. Икосаэдрические вирусы имеют форму примерно сферической формы, например, у вирусов полиомиелита или герпеса. Оболочечные вирусы имеют мембраны, полученные из клетки-хозяина, которая окружает капсиды. Вирусы животных, такие как ВИЧ, часто имеют оболочку. Головорезные вирусы заражают бактерии и имеют голову, похожую на икосаэдрические вирусы, и хвост, имеющий форму спиральных вирусов.

Многие вирусы используют какие-то гликопротеин прикрепляться к своим клеткам-хозяевам через молекулы в клетке, называемой вирусные рецепторы . Для этих вирусов требуется прикрепление для последующего проникновения через клеточную мембрану, и только после того, как проникновение произойдет, вирус может завершить свою репликацию внутри клетки. Рецепторы, которые используют вирусы, представляют собой молекулы, которые обычно находятся на поверхности клеток и имеют свои собственные физиологические функции. Похоже, что вирусы просто эволюционировали, чтобы использовать эти молекулы для собственной репликации. Например, ВИЧ использует молекулу CD4 на Т-лимфоцитах в качестве одного из своих рецепторов ((Рисунок)). CD4 - это тип молекулы, называемый молекула клеточной адгезии, который поддерживает различные типы иммунных клеток в непосредственной близости друг от друга во время генерации иммунного ответа Т-лимфоцитов.


Один из самых сложных известных вирионов, бактериофаг Т4 (который инфицирует кишечная палочка), имеет структуру хвоста, которую вирус использует для прикрепления к клеткам-хозяевам, и структуру головы, в которой находится ее ДНК.

Аденовирус, вирус животных без оболочки, вызывающий респираторные заболевания у людей, использует шипы гликопротеина, выступающие из его капсомеров, для прикрепления к клеткам-хозяевам. К вирусам без оболочки также относятся те, которые вызывают полиомиелит (полиовирус), подошвенные бородавки (вирус папилломы) и гепатит А (вирус гепатита А).

Оболочечные вирионы, такие как вирус гриппа, состоят из нуклеиновой кислоты (РНК в случае гриппа) и капсидных белков, окруженных фосфолипидной двухслойной оболочкой, которая содержит кодируемые вирусом белки. Гликопротеины, встроенные в вирусную оболочку, используются для прикрепления к клеткам-хозяевам. Другие белки оболочки - это матричные белки, которые стабилизируют оболочку и часто играют роль в сборке вирионов потомства. Ветряная оспа, ВИЧ и эпидемический паротит - другие примеры заболеваний, вызываемых вирусами с оболочкой. Из-за хрупкости оболочки вирусы без оболочки более устойчивы к изменениям температуры, pH и некоторым дезинфицирующим средствам, чем вирусы в оболочке.

В целом, форма вириона и наличие или отсутствие оболочки мало что говорят нам о том, какое заболевание может вызвать вирус или какие виды он может заразить, но они по-прежнему являются полезными средствами для начала классификации вирусов ((рисунок)).


Какое из следующих утверждений о структуре вируса верно?

  1. Все вирусы заключены в вирусную мембрану.
  2. Капсомер состоит из небольших белковых субъединиц, называемых капсидами.
  3. ДНК - это генетический материал всех вирусов.
  4. Гликопротеины помогают вирусу прикрепляться к клетке-хозяину.

Типы нуклеиновых кислот

В отличие от почти всех живых организмов, которые используют ДНК в качестве генетического материала, вирусы могут использовать либо ДНК, либо РНК. Ядро вируса содержит геном - полное генетическое содержимое вируса. Вирусные геномы, как правило, небольшие и содержат только те гены, которые кодируют белки, которые вирус не может получить из клетки-хозяина. Этот генетический материал может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Он также может быть линейным или круглым. В то время как большинство вирусов содержат одну нуклеиновую кислоту, другие имеют геномы, разделенные на несколько сегментов. Геном РНК вируса гриппа сегментирован, что способствует его изменчивости и непрерывной эволюции, а также объясняет, почему трудно разработать вакцину против него.

В ДНК-вирусах вирусная ДНК направляет белки репликации клетки-хозяина на синтез новых копий вирусного генома, а также на транскрипцию и трансляцию этого генома в вирусные белки. Заболевания человека, вызываемые ДНК-вирусами, включают ветряную оспу, гепатит В и аденовирусы. ДНК-вирусы, передающиеся половым путем, включают вирус герпеса и вирус папилломы человека (ВПЧ), который ассоциируется с раком шейки матки и остроконечными кондиломами.

РНК-вирусы содержат только РНК в качестве своего генетического материала. Чтобы реплицировать свои геномы в клетке-хозяине, РНК-вирусы должны кодировать свои собственные ферменты, которые могут реплицировать РНК в РНК или, в ретровирусах, в ДНК. Эти Ферменты РНК-полимеразы с большей вероятностью делают ошибки копирования, чем ДНК-полимеразы, и поэтому часто делают ошибки во время транскрипции. По этой причине мутации в РНК-вирусах встречаются чаще, чем в ДНК-вирусах. Это заставляет их меняться и быстрее адаптироваться к своему хозяину. Заболевания человека, вызываемые вирусами РНК, включают грипп, гепатит С, корь и бешенство. Вирус ВИЧ, передающийся половым путем, представляет собой РНК-ретровирус.

Проблема классификации вирусов

Поскольку большинство вирусов, вероятно, произошли от разных предков, систематические методы, которые ученые использовали для классификации прокариотических и эукариотических клеток, не очень полезны. Если вирусы представляют собой «остатки» различных организмов, тогда даже анализ генома или белков бесполезен. Почему?, Поскольку у вирусов нет общей геномной последовательности, которую они все разделяют. Например, последовательность 16S рРНК, столь полезная для построения филогении прокариот, бесполезна для существа без рибосом! В прошлом биологи использовали несколько систем классификации. Первоначально вирусы были сгруппированы по общей морфологии. Позже группы вирусов были классифицированы по типу содержащейся в них нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, а также по тому, была ли их нуклеиновая кислота одноцепочечной или двухцепочечной. Однако эти более ранние методы классификации группировали вирусы по-разному, потому что они основывались на разных наборах признаков вируса. Наиболее часто используемый сегодня метод классификации называется схемой классификации Балтимора и основан на том, как информационная РНК (мРНК) генерируется в каждом конкретном типе вируса.

Прошлые системы классификации

Вирусы содержат лишь несколько элементов, по которым их можно классифицировать: вирусный геном, тип капсида и структура оболочки для вирусов в оболочке. Все эти элементы использовались в прошлом для классификации вирусов ((Рисунок) и (Рисунок)). Вирусные геномы могут различаться по типу генетического материала (ДНК или РНК) и его организации (одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, сегментированные или несегментированные). В некоторых вирусах дополнительные белки, необходимые для репликации, связаны непосредственно с геномом или содержатся внутри вирусного капсида.

  • РНК
  • ДНК
  • Вирус бешенства, ретровирусы
  • Герпесвирусы, вирус оспы
  • Одноцепочечный
  • Двухцепочечный
  • Вирус бешенства, ретровирусы
  • Герпесвирусы, вирус оспы
  • Линейный
  • Круговой
  • Вирус бешенства, ретровирусы, герпесвирусы, вирус оспы
  • Папилломавирусы, многие бактериофаги
  • Несегментированный: геном состоит из одного сегмента генетического материала.
  • Сегментированный: геном разделен на несколько сегментов.
  • Вирусы парагриппа
  • Вирусы гриппа


Вирусы также можно классифицировать по дизайну их капсидов ((Рисунок) и (Рисунок)). Капсиды подразделяются на голые икосаэдрические, покрытые икосаэдрические, спиральные с оболочкой, голые спирали и сложные. Тип генетического материала (ДНК или РНК) и его структура (одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, сегментированные или несегментированные) используются для классификации ядерных структур вируса ((рисунок)).

Классификация вирусов по структуре капсида
Классификация капсидов Примеры
Голый икосаэдр Вирус гепатита А, полиовирусы
Окутанный икосаэдр Вирус Эпштейна-Барра, вирус простого герпеса, вирус краснухи, вирус желтой лихорадки, ВИЧ-1
Обернутый спиральный Вирусы гриппа, вирус паротита, вирус кори, вирус бешенства
Голая спиральная Вирус табачной мозаики
Комплекс со многими белками, у некоторых есть комбинации икосаэдрических и спиральных структур капсида. Герпесвирусы, вирус оспы, вирус гепатита В, бактериофаг Т4


Балтиморская классификация

Наиболее распространенная и используемая в настоящее время система классификации вирусов была впервые разработана биологом Дэвидом Балтимором, лауреатом Нобелевской премии, в начале 1970-х годов. В дополнение к различиям в морфологии и генетике, упомянутых выше, схема классификации Балтимора группирует вирусы в соответствии с тем, как мРНК продуцируется во время репликативного цикла вируса.

Вирусы группы I содержат в качестве генома двухцепочечную ДНК (дцДНК). Их мРНК производится транскрипцией почти так же, как и клеточная ДНК, с использованием ферментов клетки-хозяина.

Вирусы группы II имеют в качестве генома одноцепочечную ДНК (оцДНК). Они превращают свои одноцепочечные геномы в промежуточную дцДНК до того, как может произойти транскрипция в мРНК.

Вирусы группы III используют дцРНК в качестве своего генома. Нити разделяются, и одна из них используется в качестве матрицы для генерации мРНК с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, кодируемой вирусом.

Вирусы группы IV имеют в качестве генома оцРНК с положительная полярность, что означает, что геномная РНК может служить непосредственно мРНК. Промежуточные звенья дцРНК, называемые репликативные промежуточные продукты , создаются в процессе копирования геномной РНК. Множественные полноразмерные цепи РНК отрицательная полярность (комплементарные геномной РНК с положительной цепью) образуются из этих промежуточных продуктов, которые затем могут служить в качестве матриц для продукции РНК с положительной полярностью, включая как полноразмерную геномную РНК, так и более короткие вирусные мРНК.

Вирусы группы V содержат геномы оцРНК с отрицательной полярностью, что означает, что их последовательность комплементарна мРНК. Как и в случае с вирусами группы IV, промежуточные соединения дцРНК используются для создания копий генома и производства мРНК. В этом случае геном с отрицательной цепью может быть преобразован непосредственно в мРНК. Кроме того, полноразмерные положительные цепи РНК служат в качестве матриц для производства генома с отрицательной цепью.

Вирусы группы VI имеют диплоидные (две копии) геномы оцРНК, которые необходимо преобразовать с помощью фермента обратной транскриптазы в дцДНК, дцДНК затем транспортируется в ядро ​​клетки-хозяина и вставляется в геном хозяина. Затем мРНК может быть получена путем транскрипции вирусной ДНК, которая была интегрирована в геном хозяина.

Вирусы группы VII имеют частичные геномы дцДНК и образуют промежуточные звенья оцРНК, которые действуют как мРНК, но также преобразуются обратно в геномы дцДНК с помощью обратной транскриптазы, необходимой для репликации генома.

Характеристики каждой группы в классификации Балтимора обобщены на (Рисунок) с примерами каждой группы.

Балтиморская классификация
Группа Характеристики Способ производства мРНК Пример
я Двухцепочечная ДНК мРНК транскрибируется непосредственно с матрицы ДНК Простой герпес (вирус герпеса)
II Одноцепочечная ДНК ДНК преобразуется в двухцепочечную форму до того, как РНК транскрибируется. Парвовирус собак (parvovirus)
III Двухцепочечная РНК мРНК транскрибируется из генома РНК Детский гастроэнтерит (ротавирус)
IV Одноцепочечная РНК (+) Геном функционирует как мРНК Простуда (пикорнавирус)
V Одноцепочечная РНК (-) мРНК транскрибируется из генома РНК Бешенство (рабдовирус)
VI Одноцепочечные РНК-вирусы с обратной транскриптазой Обратная транскриптаза превращает ДНК в геном РНК. Затем ДНК включается в геном хозяина. МРНК транскрибируется из встроенной ДНК. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)
VII Двухцепочечные ДНК-вирусы с обратной транскриптазой Вирусный геном представляет собой двухцепочечную ДНК, но вирусная ДНК реплицируется через промежуточную РНК, РНК может служить непосредственно как мРНК или как матрица для создания мРНК. Вирус гепатита В (гепаднавирус)

Резюме раздела

Вирусы - это крошечные неклеточные образования, которые обычно можно увидеть только в электронный микроскоп. Их геномы содержат либо ДНК, либо РНК, но не обе сразу, и они реплицируются либо с помощью белков репликации клетки-хозяина, либо с помощью белков, закодированных в вирусном геноме. Вирусы разнообразны, они поражают архей, бактерии, грибы, растения и животных. Вирусы состоят из ядра нуклеиновой кислоты, окруженного белковым капсидом с внешней липидной оболочкой или без нее. Форма капсида, наличие оболочки и состав ядра определяют некоторые элементы классификации вирусов. Наиболее часто используемый метод классификации, классификация Балтимора, классифицирует вирусы на основе того, как они производят свою мРНК.

Искусство Связи

(Рисунок) Какое из следующих утверждений о структуре вируса верно?


Новое открытие показывает, что клетки человека могут записывать последовательности РНК в ДНК

Клетки содержат механизм, который дублирует ДНК в новый набор, который попадает во вновь сформированную клетку. Тот же класс машин, называемых полимеразами, также создает сообщения РНК, которые похожи на заметки, скопированные из центрального хранилища рецептов ДНК, поэтому их можно более эффективно считывать в белки. Но считалось, что полимеразы работают только в одном направлении ДНК в ДНК или РНК. Это предотвращает перезапись сообщений РНК обратно в книгу рецептов геномной ДНК. Теперь исследователи из Университета Томаса Джефферсона предоставляют первое свидетельство того, что сегменты РНК могут быть записаны обратно в ДНК, что потенциально бросает вызов центральной догме биологии и может иметь широкие последствия, влияющие на многие области биологии.

«Эта работа открывает двери для многих других исследований, которые помогут нам понять важность наличия механизма преобразования сообщений РНК в ДНК в наших собственных клетках», - говорит Ричард Померанц, доктор философии, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии в Университете Томаса Джефферсона. . «Тот факт, что человеческая полимераза может делать это с высокой эффективностью, вызывает много вопросов». Например, это открытие предполагает, что сообщения РНК могут использоваться в качестве шаблонов для восстановления или перезаписи геномной ДНК.

Работа опубликована 11 июня в журнале. Наука продвигается.

Вместе с первым автором Гурушанкаром Чандрамули и другими сотрудниками команда доктора Померанца начала с исследования одной очень необычной полимеразы, называемой полимеразой тета. Из 14 ДНК-полимераз в клетках млекопитающих только три выполняют основную часть работы по дублированию всего генома для подготовки к делению клетки. Остальные 11 в основном участвуют в обнаружении и ремонте разрыва или ошибки в цепях ДНК. Полимераза тета восстанавливает ДНК, но очень подвержена ошибкам и допускает множество ошибок или мутаций. Поэтому исследователи заметили, что некоторые из «плохих» качеств полимеразы тета были такими же, как и у другой клеточной машины, хотя еще одно распространено у вирусов - обратная транскриптаза. Как и Pol theta, обратная транскриптаза ВИЧ действует как ДНК-полимераза, но также может связывать РНК и считывать РНК обратно в цепь ДНК.

В серии элегантных экспериментов исследователи протестировали тета-полимеразу против обратной транскриптазы ВИЧ, которая является одной из наиболее изученных в своем роде. Они показали, что полимераза тета способна преобразовывать сообщения РНК в ДНК, что она и делает так же, как и обратная транскриптаза ВИЧ, и что она действительно работает лучше, чем при дублировании ДНК в ДНК. Полимераза тета была более эффективной и вносила меньше ошибок при использовании матрицы РНК для записи новых сообщений ДНК, чем при дублировании ДНК в ДНК, предполагая, что эта функция могла быть ее основной целью в клетке.

Группа сотрудничала с лабораторией доктора Сяоцзян С. Чен в USC и использовала рентгеновскую кристаллографию для определения структуры и обнаружила, что эта молекула способна изменять форму, чтобы приспособиться к более объемной молекуле РНК - подвиг, уникальный среди полимераз.

«Наши исследования показывают, что основная функция полимеразы тета - действовать как обратная транскриптаза», - говорит д-р Померанц. «В здоровых клетках целью этой молекулы может быть РНК-опосредованная репарация ДНК. В нездоровых клетках, таких как раковые клетки, полимераза тета сильно экспрессируется и способствует росту раковых клеток и устойчивости к лекарствам. Будет интересно понять, как активность полимеразы тета на РНК способствует репарации ДНК и пролиферации раковых клеток ».

Это исследование было поддержано грантами NIH 1R01GM130889-01 и 1R01GM137124-01, а также R01CA197506 и R01CA240392. Это исследование также было частично поддержано грантом Фонда исследования рака в Башне.